酵母菌的蛋白表現

[ernielwl (ernielwl)]

表現真核生物的蛋白質的時候通常選用酵母菌
而非細菌是因為同樣為真核生物可以做修飾

真核生物的基因一般都帶有Intron
所以都是由mRNA轉成cDNA來做表現

理論上mRNA用Oligo dT當作Primer做RT-PCR轉成cDNA
但是我Boss說實際上mRNA在操作時候容易斷掉，很難只用dT primer做成功
一般都用Random primer比較合理

然後要PCR做出全長2k以上的cDNA不容易
所以現在都改用直接拿序列給廠商合成DNA的方式去做了

那小弟想說，為什麼不直接拿gDNA去給酵母菌表現呢？
同為真核生物應該也有剪切Intron的功能吧？
但是Boss說都沒有人這樣做......

如果是因為物種差異造成intron splicing不同
那要做真菌的蛋白質表現成功率是否可能會比較高呢

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※ 編輯: ernielwl (180.217.199.95), 09/14/2017 22:35:39
→ blence: 如果可以拿gDNA給酵母菌表現的做法,那不就可以把total RNA
→ blence: 丟給酵母菌做了？
如果只是針對某一段蛋白，cds 2kb而 gDNA含intron 5k左右
→ blence: 如果說mRNA容易斷掉,random hexamer也無法克服這個問題
→ blence: 我認為是接的clone太少,才會說2k以上的cds cDNA不容易
我Boss說用dT primer就只能從尾巴往前P，如果中間斷了就做不出來，Random就有機會做
出前面或中間的片段
所以拿cDNA做Template時候，primer設計夾出的片段一次大概1kb以下，太長會失敗，要
做出2K以上的cds都要分3~4段起來組
※ 編輯: ernielwl (180.217.199.95), 09/14/2017 23:17:47
推 joseph103331: 你可以試試看,不過這已經可以另成題目,有太多可能的
→ joseph103331: 問題弄在裡面,你又不是要設計表現系統的人....
→ joseph103331: 而且多加一個splicing在表現過程中,天知道會多出來
→ joseph103331: 甚麼奇怪的東西
我Boss有開玩笑說要我去表現gDNA，反正去抽酵母菌RNA比對gDNA就知道splicing的方式
對不對，有點苦笑不得XD
※ 編輯: ernielwl (180.217.199.95), 09/15/2017 00:25:54
→ xxtomnyxx: 以現在的技術這根本不是問題，我用 dT20VN 做 RT，
→ xxtomnyxx: 5'-UTR 5 kb ORF 3.6 kb 的基因照 clone 不誤。
→ xxtomnyxx: 不只是因為 splicing 的問題，真核生物一堆 intron 不
→ xxtomnyxx: 知道在大幾點的，gene body 隨便都破 10 kb，這麼大的
→ xxtomnyxx: 序列要放到 vector 上只能用 BAC 或 YAC，但是操作這些
→ xxtomnyxx: vector 比操作 plasmid 麻煩的多。況且也沒多少 polyme
→ xxtomnyxx: rase 能夠放大出超過 10 kb 的序列。
tomny大講的都對，只是目前我lab要表現的蛋白其實挺短的，cds 2k ,gDNA 4k而已  所
以有點想嘗試看看
※ 編輯: ernielwl (180.217.217.30), 09/15/2017 17:37:44
→ blence: 你的前提是建立在該基因的gDNA只有一種transcript,如果你
→ blence: 的是人類基因,可以去ensembl看有多少alternative splicing
→ blence: 然後再去推敲該基因在酵母菌的剪接會不會比在人類還精確?
推 Ianthegood: 當然有人這樣做啊怎麼沒有 如果又是fungus那表現成功
→ Ianthegood: 機率就真的很高了
→ Ice9: 不建議用人的intron去給酵母切，除非你確認過那序列在酵母沒
→ Ice9: 問題。另外，promoter序列有時會影響剪接效果。
→ Ice9: 而且，酵母中的intron普遍遠短於人類的長度，頂多上千nt.，
→ Ice9: 所以很可能會造成意外。如無特別需求，還是別考慮用這種方式
→ Ice9: 酵母-->酵母菌