[求救] Western Blot做出來的band會歪向一邊

[enjoyable264 (enjoy)]

各位Western Blot 大大好
目前在做Sucrose gradient 跑超高速離心的實驗
想了解細胞膜上蛋白在lipid raft上的位置

以下實驗步驟參考論文所述
細胞收自100mm dish
加入850ul Sodium Carbonate刮下所有細胞也一併加入蛋白酶抑制劑了
將850ul混合90%Sucros再依續疊上不同濃度的Sucrose
上機離心overnight後共收了10個layer
各別加入Sample buffer 98度煮10分鐘

接下來進入WB步驟
10% gel
Running condition: 80V 30min後再120V 100min
Transfer condition: 400mA 2hr(只剩marker上面一點點殘留在膠上其他的都過去了)
Blocking: 3% skim milk 1hr
1st Ab: Santa Cruz Ab 1:100 overnight 4度
Wash 三次共60min
2nd Ab: HRP 1hr at RT
Wash
呈色用Thermo家出的Femto呈色
結果出現band往左移的現象，而且也不夠Sharp
想請問各位高手是否有方法可以改善
重覆很多次都要崩潰了
附上圖連結https://imgur.com/Dj9w6p6
感謝大家

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推 tynse71864: sucrose再加 sample bfr會非常稠; load膠前先vtx混勻
→ tynse71864: 再 load，或是 sample用水稀釋些可能可以解決
推 tynse71864: 最左跟右是 Mr嗎?
→ enjoyable264: T大 是marker沒錯
→ enjoyable264: Loading之前都有vortex過了，加水稀釋我怕protein量
→ enjoyable264: 太少
推 joseph103331: 怕太少就多收點，不然就做透析或蛋白質沉澱
推 cyc5566: 其實我覺得做這樣夠漂亮了
推 tynse71864: 膠多厚呢
→ enjoyable264: 1.5mm