[求救] IHC品質不穩定

[raylie9093 (Ray)]

大家好，目前遇到的ＩＨＣ狀況品質容易不穩定
染色出來可能同一批有些結果很漂亮很正常，但也會有很差的（操作的都是臨床檢體）

同個control出來的深淺區塊不ㄧ致，有片子的很濃、有些很淡

或者同sample的結果深淺有落差、染上的區塊會有點不太一樣，是有猜可能切片的切面可能也會影響到這件事


大致上的步驟如下

1.Deparaffin(in Xylene) 3次 2min
2.Hydration 100%Alc-95%Alc-75%Alc-H2O-H2O  各1次 2min
3.Antigen retrieval in autoclave 10-15min

然後用Kit，大致上是：
1.peroxidase     5min
2.blocking     5min
3.primary antibody    室溫1hr
4.post-antibody     10min
5.polymer    10min
6.DAB 5min
7.Hematoxylin 5min

不知道是不是哪個環節該調整或者操作時該注意的，可以做出穩定的品質？

如果Deparaffin 和 Hydration的時間加長 （變2min30sec是否足夠？) 可以改善嗎？
但是會不會因此容易掉片（用coating片操作前也烤過）

還是有其他的可以給我一點建議？謝謝！



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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1509025072.A.DF9.html
推 johanjohan: 1.檢體是否固定不良？2.有無使用防水筆，避免實驗過程
→ johanjohan: 乾掉。
1.formalin的固定還是烤片？
2.有用防水筆圈，也有注意乾掉的問題，但是怎樣才算真的乾掉？
因為我在圈檢體的時候，大致上就是擦乾到想圈的範圍，然後用防水筆圈
大概看檢體上是有薄薄的水分，還是動作要再快一點？
因為我又怕範圍擦不乾防水筆暈開
其他的實驗步驟就盡量讓片子保持水份的狀態
※ 編輯: raylie9093 (180.217.235.218), 10/26/2017 22:26:48
→ abcam: IHC的片子 即使是positive片子，也不會顏色深淺都一致。
推 cv5754515: 依我的經驗是實驗條件以及kit的效果問題，試著peroxdia
→ cv5754515: se 20min
推 cv5754515: Blocking 37度烘箱 30min。DAB 呈色時在顯微鏡下觀察
→ cv5754515: 變化，不一定要五分鐘，看情況調