[求救] WBㄧ直壓出白白ㄧ片

[dasiy3112001 (~讓我考上吧~)]

https://i.imgur.com/iTNqMch.jpg
最近WB壓片結果ㄧ直像上圖ㄧ樣。
上膠: 60V 40~50min
下膠:90-100V-
-transfer:100V 90min
blocking:1hr
1抗 O/N
0.05%TBST wash*4共40min
2抗 1hr
0.05%TBST wash*4共40min

之後ECL就去壓片。
之前用同樣條件都壓的出來,
近期不知道發生什麼事就ㄧ直重覆ㄧ樣的失敗!
我的10X running配方如下圖
https://i.imgur.com/4UbzNJp.jpg
已經ㄧ個星期沒進度了，拜託大家幫我看看哪裡出問題了。

謝謝大家

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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1510998017.A.089.html
推 joseph103331: 這時候你需要Positive control, 之前有沒有留樣本?
→ joseph103331: 把之前的樣本配合現在的再跑一次, 若還是沒有, 抗體
→ joseph103331: 出問題的可能性較大
→ e104582001: 個人不認為一抗有問題，感覺應該是有用不同一抗
→ e104582001: ECL壞的機率比較小，試試看換換2抗?
→ e104582001: 膠也有可能有出問題，這都要去試試看才知道
→ e104582001: 從右下的圖來看可能是跑完膠就有問題了
→ e104582001: 轉染之後染看看 ponceau S Y
→ e104582001: 若是真的懷疑buffer有問題就先重配個1L的1X running
→ e104582001: buffer 跑看看就知道了
推 isdorothy: 你的actin也這樣嗎
推 tynse71864: 需要 positive Ctrl 不然可能性太多了捏
→ dasiy3112001: actin也ㄧ樣這樣，所以才覺得很怪！
推 MDCCLXXVI: Marker有transfer ok嗎？
→ osla30: running的glycine 144g為什麼要劃掉？
推 as862437: transfer 的buffer有更新嗎？用太多次轉印效率會變差
→ dasiy3112001: Marker每次都有的轉過去，transfer buffer用reuse
→ dasiy3112001: 的我也都會加至少ㄧ半全新的ㄧ起用。running配方我
→ dasiy3112001: 也覺得有問題
→ blence: runngin buffer這裡,有人用144g,也有用192g,都跟你寫不同
→ blence: 文章先說marker有跑開,就比較好猜測跟running無關
→ blence: 另外transfer每次都是半新半舊,應該很少人這麼用吧？
推 joseph103331: Transfer我們都可以用到8次,每次1~1.5hr還是可以做
→ bj59420: transfer buffer全部重配呢？不要用舊的試試看
→ bj59420: 之前實驗室發生過marker過去但也壓不出東西，換人配buffe
→ bj59420: r就沒事了
→ dasiy3112001: 好，我已重配了！謝謝大家
推 sonny77: Transfer buffer重配 可能有配錯
推 michealking: 膠染一下就知道啦
推 untilnow: 你加完ecl到壓片多久？1/2抗品牌和濃度？
→ dasiy3112001: 謝謝大家，結果發現是二抗壞掉，感謝大家提供可能
→ dasiy3112001: 的錯誤資訊，謝謝。
推 charliedorae: 二抗可重配