[討論] Taqman gene expression assay

[blence ( )]

  Taqman assay最常用的是FAM或VIC兩種螢光
  對於同一個基因表現，不知道分別使用不同螢光探針上機
  那麼獲得的CT會不會有所不同？

  平常的實驗會把control跟target加入同一種螢光偵測
  所以不會遇到上面的困擾
  只是目前實驗會需要在一個tube中同時加入FAM或VIC去偵測target表現
  而control就不確定只用FAM即可，或要同時加入VIC？

  因為target_FAM或許可以從control_FAM計算deltaCT
  但是target_VIC也跟著control_FAM去計算deltaCT的話，就覺得有些怪怪的

  這問題詢問專員，回覆提到理論上CT不受螢光種類而有差異
  不過實際上的有沒有影響，還是詢問一下有沒有人有相關經驗
  謝謝


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.218.151.4
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1513000070.A.0FF.html
推 qiet: 不同螢光強度當然有差 有差就可能影響單個樣品的Ct值，但理
   Thermo的專員認為同一樣品，不同螢光的強度雖然有差，但CT應該會相同
   不過沒data的話我是存疑
→ qiet: 論上不影響不同樣品間的相對值，就像你用Sybr green測同一
→ qiet: 個gene但用不同primer會有差異是差不多的
   後面這兩句我看不懂

   用貼近實驗的結果來做假設好了
   在只放一對A gene primer的singleplex Taqman PCR reaction中
   同時存在FAM與VIC兩種螢光probe用來偵測A gene表現，
   CT的部分，A_FAM=20，A_VIC=22
   而internal control，GAPDH_FAM=15，GAPDH_VIC則是我的問題

   假使如原廠的推測GAPDH_VIC=15，與GAPDH_FAM沒有差異
   那A的兩個螢光都只要跟GAPDH_FAM算相對值即可，不需要再多買GAPDH_VIC來混合
   結論就是A_FAM的表現量比較多

   但是萬一GAPDH_VIC=/=15，或有幾個CT的差異
   那我的A_FAM與A_VIC就必須依照各別的螢光去算相對值
   這時候前面的結論就不一定正確了


推 supray: 只看ddCt還OK,因為是把control樣本當1去做normalize，
→ supray: 如1樓所說，比較的是不同樣本的表現量
→ supray: 但你的比較方式就有點問題，只取dCt
→ supray: 不同primer或不同probe，最好是要當成不同的target
→ supray: 因為primer濃度，螢光強弱，threshold的值都會影響Ct
→ supray: 在同個樣本間無法比較
  我的最終目的當然是要比較ddCT
  上面只是先聚焦在只有一個樣本時，
  A_FAM, A_VIC與GAPDH_FAM的相對量該如何比較

  如果無法凸顯同一樣本內的A_FAM與A_VIC有所不同
  自然就無法從接續往後不同樣本的實驗設計

  如果我的理解沒錯
  目前看起來就算是同一樣本,primer,濃度,實驗條件....種種因素都相同的情況下
  上面兩位都認為改變不同的probe螢光,就會導致CT值改變的樣子

※ 編輯: blence (180.218.151.4), 12/13/2017 01:36:20
→ supray: 那就需要有一個確定是A_FAM,A_VIC target 1:1的樣本
→ supray: 當作是你的標準品
※ 編輯: blence (180.218.151.4), 12/13/2017 01:41:16
→ Invec: 將該片段進行TA cloning作為標準品 每次上機做絕對定量即可
→ Invec: 標準曲線需分螢光做