[求救] 關於Luciferase轉染到Fibroblasts疑問

[belle0625070 (云云)]

最近實驗進行到將克隆在pGL3 basic裡的DNA片段用Luciferase測試表現程度。

目前測試條件為：24孔板，每孔400ng DNA，1ul Lipo2000，有使用pGL4.74為對照，每孔濃度0.1ng，

在60%細胞滿盤時轉染，中間不換液，等待36小時裂解後讀盤。

(我做的事之前實驗室助理教我的，但是我有在網上查到轉染時建議用沒有血清也沒有抗生素的培養液，

而且六小時後換含血清不含抗生素的培養液，不知道是否適合我的情況？)

老師希望我使用Lipofectamine 2000轉染這些Plasmid到Fibroblasts，實驗結果，最高的數字大約是六百多。

但數據老師不太滿意，告訴我"the efficiency is not enough"。

想請問大家，如何的efficiency才是達到標準...

不知道這是不是一個很基礎的問題，但因為是半路轉行所以有一些基礎知識不懂，查了文獻之後心中仍然感到疑惑沒有找到答案，

希望有經驗的大大能幫忙回答或是指點一下方向，感謝

--
Sent from my Windows

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 198.184.147.19
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1515538693.A.173.html
→ turtle24: 600多是對照組的值嗎？
→ turtle24: 有很多地方需要檢驗，像是質體的品質，細胞本身好不好
→ turtle24: 轉殖
→ turtle24: 如果材料跟步驟都是前人留下的又沒人能討論會比較難找
→ turtle24: 原因
→ turtle24: 抱歉因為網路問題好像多送出一段推文
→ belle0625070: 600~1000左右是實驗組的值，對照renilla大約是100出
→ belle0625070: 頭
→ belle0625070: 老師有說過這種細胞轉染效率本來就不好，但是我很疑
→ belle0625070: 惑的是，那怎麼樣的數據才是能夠接受的
→ milkpa: 用相對值，不要用絕對值
→ xxtomnyxx: Renilla 太低了，這樣很危險。
→ xxtomnyxx: 你測測看一組只放 ffLuc 和一組只放 rLuc 去測，你
→ xxtomnyxx: Renilla 讀值 100 出頭以 Luciferase assay 來說太接近
→ xxtomnyxx: background 了。然後如果是質疑你 transfection 效率，
→ xxtomnyxx: 你就做一次 transfect 表現 EGFP 的 vector，看有 EGFP
→ xxtomnyxx: 表現的細胞有多少，在和前人或網路上同細胞株的實驗對
→ xxtomnyxx: 照，就可以知道是你轉染不好還是該段 DNA 本身的
→ xxtomnyxx: transcriptional activity 很差了。
→ xxtomnyxx: 另外，用無血清培養基 transfection 的問題，我個人用
→ xxtomnyxx: lipo2000 和 lipo3000 都做過測試，至少在我用的細胞株
→ xxtomnyxx: 上幾乎沒有影響，不過這可能取決於培養基種類和細胞種
→ xxtomnyxx: 類，比起問人得到含糊不清的答案，自己測試看看才是最
→ xxtomnyxx: 有效的解決辦法
推 joseph103331: 我們是至少混DNA時要無血清，有些資訊甚至會連抗生
→ joseph103331: 素都不建議添加，真的要試過才會知道。總之先分析
→ joseph103331: 一下做相同細胞的paper選用的條件，然後再用GFP測
→ joseph103331: 試轉染效率，最好連liposome跟DNA的比例都titrate
→ joseph103331: 一下比較好，不同細胞在做luc的時候讀值也不同，我
→ joseph103331: 們老師至少要求到千位，然後相對量比絕對量重要，
→ joseph103331: 給你參考一下。
→ blence: "600~1000左右是實驗組的值，對照renilla大約是100出頭"
→ blence: 原po推文這句話,不像是co-transfect操作的描述方式
→ blence: 也不知道100是指純pGL4.74的值,還是pGL3/pGL4.74的相對值
→ belle0625070: 補充說明一下，我每孔是加0.1ng的pGL4.47以及400ng
→ belle0625070: 的DNA
→ belle0625070: 感謝大家意見，明天馬上先選一組DNA測試看看1ng per
→ belle0625070:  well renilla 在ffLuc/rLuc還有血清與抗生素移除與
→ belle0625070: 否的差別。