› 看板 Biotech 關於我們 聯絡資訊
作者sunnyandsund (sunny)
看板Biotech
標題[求救] western blot壓出空白片
時間Sat Jan 20 23:53:33 2018
我最近在做western blot 我大學到研究所期間都做過western blot 都有做出結果 現在到其他實驗室做WB卻做不出來 實驗室的人幾乎都做過WB 只是不是在這間實驗室做的 是在其他實驗室做的 所以東西藥品是舊的 細胞蛋白抽取後測完濃度冰到-80 然後加6X sample buffer煮5分鐘 loading到10% SDS PAGE上膠80V 下膠120V marker有分開 transfer buffer 是用tris和glycine也有加20% methanol和0.4% SDS transfer用biorad 的tank 條件是300mA 1.5hr 轉到NC membrane上 marker每條都有轉過去 然後因為之前第一次做的時候也是都空白片 所以這次有用ponceus S染膜 卻沒染出任何東西 我們沒有染膠 因為沒有comasin blue 然後就5% milk blocking 一抗目標抗體1:1000 overnight 二抗anti-mouse 1:5000 暗房壓片 ECL作用3分鐘 壓片5分鐘 底片超乾淨 沒東西 strip後 blocking 1hr 1Ab anti-bactin 1:5000 overnight 4度C 2ab anti-mouse 1:5000 1hr RT TBST wash 三次 十分鐘後 暗房壓片 ECL作用3分鐘 壓片10分鐘 底片很乾淨沒東西 想問這是什麼問題? 還有因為我以前都是用PVDF膜 但這裡是用NC的 我的transfer條件是用以前的方式 想問NC的transfer 條件是? 就是關於時間和安培的部分 謝謝 我真的做到快崩潰 希望大家解救阿 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 220.132.101.105 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1516463615.A.21E.html
→ milulittle: 奶粉是好的嗎 01/21 01:35
→ e104582001: NC用法很不一樣... 01/21 01:50
→ aj1139: 我跟你的方法幾乎完全一樣 01/21 08:24
→ aj1139: 換成PVDF就好了 01/21 08:24
→ aj1139: 網路上的相關討論指出，可能是ECL過期。https://goo.gl/D 01/21 08:33
→ aj1139: Q18Nv 01/21 08:33
→ aj1139: https://goo.gl/DQ18Nv 01/21 08:33
推 aj1139: 我目前的lab也是NC membrane做不出來，雖然我自己覺得這 01/21 08:35
→ aj1139: 東西沒有過期的問題，但由於我同樣的做法換成PVDF就做出 01/21 08:35
→ aj1139: 來了，實在讓我不得不懷疑NC 01/21 08:35
→ turtle24: ponceus S沒染到東西，會不會是定量或稀釋的問題 01/21 08:58
→ ender: 我是這篇的原PO,因為我的帳號暫時不能回,我先借別人的回 01/21 13:35
→ ender: M大 我的牛奶是新買的,應該是沒問題.E大想請問NC用法不同, 01/21 13:36
→ ender: 是指哪方面不同?那他transfer的條件是? 01/21 13:37
→ ender: A大 我們目前可能不太能換成PVDF阿 01/21 13:38
→ ender: 想請問為何ponceus S沒染到會是蛋白稀釋和測濃度的問題? 01/21 13:39
推 joseph103331: NC有點脆弱不太能strip,ponceus S沒染到東西很怪 01/21 16:46
推 ABULA666: 好奇如果你現在待的實驗室是用NC片，有參考先前的操作方 01/21 22:41
→ ABULA666: 法嗎？如果沒有，你寫的步驟從何處參考？不過除了這些， 01/21 22:42
→ ABULA666: 用Ponceus S染膠沒染出東西問題更大，應該是前處理樣本 01/21 22:43
→ ABULA666: 就有問題。 01/21 22:43
→ aj1139: 如果你人在台北，我借你PVDF跟comassie blue做troublesho 01/22 07:46
→ aj1139: oting如何？有需要請私 01/22 07:46
推 pent: gel 上有東西嘛？ 01/22 16:14
→ blence: NC有看到marker,ponceus S沒染到band,先去關心有無蛋白 01/22 17:16
推 TAKONA: 我實驗室用GE NC膜, transfer 300mA 2 hr 01/23 03:18
推 exosome: Transfer 時取消 0.4% SDS 試試 03/03 13:37