[求救] flow cytometry分析細胞凋亡問題

[kevinlee075 (逐夢彗星)]

小弟之前做別的細胞染Annexin V和PI上flow都很正常，但是最近用HepG2做實驗，結果每次跑出來光是control就死了一堆，四象限中除了本來正常的那群細胞外都會多一坨在左上方，如下圖
https://i.imgur.com/wqXqHQZ.png
由於自己操作的經驗以及爬文有很多人都說到這個細胞很黏，因此我在上機前收集活細胞的階段試過本來濃度的TE(小弟平時都用2倍，作用3分鐘)也試過5倍TE作用1分鐘來將細胞打下來，並且將處理時間控制在半小時內，但是結果並沒有差異太大，請問各位對於flow操作以及養過HepG2的大大，我該怎麼辦才能不會出現左上那坨死細胞?

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→ greenmoon00: 我覺得這坨染pi的不是死細胞，應該只是沒打散黏在一
→ greenmoon00: 起,建議FS-SS那張圖去框出單細胞的群,再把這群做fl1
→ greenmoon00:  fl3的分析
推 greenmoon00: 如果會做cell cycle的flow,補個sub-G1更可以驗證你
→ greenmoon00: 凋亡的結果
→ kevinlee075: 可是我是已經過篩了才上機的，這樣也會有沒打散的細
→ kevinlee075: 胞嗎？
推 ChesterYeah: 有做starvation嗎
推 ChesterYeah: 再來，你的cell cycle 圖可以借看一下嗎
推 ChesterYeah: 你的annexin v顏色有選過？
推 ChesterYeah: 說錯，以往看Pi記得是用FL2..
→ ChesterYeah: 圖中只可以解釋，你細胞品質可能有問題
推 ChesterYeah: 可能你打細胞手法要更溫和一點
→ ChesterYeah: 細胞滿度多少？ HepG2 記得長蠻快的
→ ChesterYeah: 通常會用大盤養別太密集 以免抑制生長
→ kevinlee075: 我沒有做過cell cycle耶，所以可以試試看是嗎？還有
→ kevinlee075: 我用六公分種10^6個細胞做48 h看起來大概也只有七八
→ kevinlee075: 分滿而已
→ kevinlee075: 用FL2或FL3會有差嗎？我之前實驗室學姐教我的時候就
→ kevinlee075: 是都設定FL3，做其他細胞也很ok
推 greenmoon00: 通常建議做fl3, fl2容易受AnexinV影響,但是cell cycl
→ greenmoon00: e可以試fl2
推 ChesterYeah: 要調螢光補償
推 ChesterYeah: 單獨開一個PI channel 去看PI上去的程度
→ ChesterYeah: FL幾主要是看你螢光物波段
→ ChesterYeah: annexin V也可以是別的色
推 ChesterYeah: 你可能要測一下細胞週期喔，不然狀態好壞會不太準