[求救] XbaI 限制酶digestion切不完整

[fishg1216 (葉綠體)]

大家好!
最近我要做southern blot檢測轉殖株基因體內轉基因套數，但在digestion發生了問題!
由於老闆要求需要分別用三個不同限制酶檢測套數，於是我選用了EcoRI, BamHI及XbaI。
前兩個酵素都很成功的將不同轉殖株wild type和positive control 之15 ug DNA切割成s
mearing條帶，但XbaI卻在少數三管DNA (包含wild type, 如下圖 5th, 10th, 25th well
) digested不完全, 因此想求助大家原因出在哪裡?
謝謝大家!

https://i.imgur.com/1d8WgEc.jpg
以下附上digestion 條件
DNA                         15 ug
10X buffer Tango             2 ul
Fermentas XbaI (10U/ul)      2 ul
補dH2O至體積為20 ul

37℃ 16小時

註:
1. 三支酵素digestion條件完全相同,差別只在使用的buffer種類不同
2.皆使用同一管DNA


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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1521194033.A.B4F.html
推 joseph103331: DNA methylation? 找一個沒有methylation影響的酵素
→ joseph103331: 吧~
推 tynse71864: xbai 有些會有甲基化喔  會切不動
→ a90648: XbaI要注意用的菌種，methylation後會切不動
推 july81212: XbaI遇到methylation 就且不動喔 換菌種看看
謝謝大家的回應，但昨天我換了一支酵素NEB的PvuII，切 1 ug DNA，其他條件相同，
仍然切不動。有查過NEB網站確認過PvuII不會受甲基化影響，請問會是什麼原因?
※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/17/2018 12:39:26
→ fishg1216: https://i.imgur.com/riR9eYl.jpg
推 joseph103331: 有沒有Non-digested作為control?
→ blence: XbaI是對dam敏感,但你的轉殖株應該沒有這種methylase吧
→ fishg1216: to j大，不好意思沒做cotrol; to  b大，怎樣確認有無
→ fishg1216: 此methylase? 謝謝!
→ blence: 我是回應前面推文都提到菌種,可是你只提到轉殖株,沒說是菌
→ blence: Ecoli才有dam,就算XbaI對dam敏感,也要看你用轉殖株是什麼
→ fishg1216: 轉殖株材料是番茄