[求救] site-directed mutagenesis

[shauosan ()]

最近在做A基因靠近3端不足100bp的點突變,
primer設計如下:

                              F -----m----------->
   5' ------------------------------------------------------3'
      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
      ------------------------------------------------------
                        <------------m----- R

Forword primer長度30bp
Reverse primer長度32bp，m為突變位置，兩條primer中間overlap 10bp，
Tm值都大約60、61左右，
目標為6.6kb左右的plasmid，但我一直都P不出來。

PCR材料照phusion產品說明的:
ddH2O                   add to 20ul
5X Phusion HF buffer            4ul
10mM dNTPs                    0.4ul
Forward primer                  1ul
Reverse primer                  1ul  (primer final concentraction 0.5uM)
template                        1ul
3% DMSO                       0.6ul
phusion                       0.2ul
__________________________________________
                  total volumn 20ul

PCR condition:
98℃  30s      __
98℃  10s       |
55℃  30s       |  25cycle
72℃  3min20s  _|
72℃  5min
25℃  ∞

template有試過放不同量0.1ng、1ng、5ng、10ng，有加DMSO or 沒加，
但PCR一直都跑不出來，
後來有試著用DpnI digest後再拿去transform看看，有長colony，但都萃不到質體。

之前在文獻有看到有人說靠近3端的點突變不能直接做，
那篇是用兩條延伸到plasmid的primer做，接著進行融合PCR，最後在clone回質體，
不知道這會不會是p不出來的原因?
(可是plasmid不是圓的嗎?問了實驗室有在做的人都覺得這說法不太合理)


因為之前沒經驗，問了實驗室的人才知道他們都是用complement priemr做，
目前想到的就是重訂primer，
不知道版友對於這個情況有沒有什麼建議?

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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1524902269.A.F90.html
→ blence: 用quikchange的方法,完全沒有什麼靠近3端不能做的問題
推 joseph103331: 為什麼primer這麼長, overlap這麼少?
推 osla30: 用primer back to back方式，不overlap，幾乎百分百成功率
推 uouim: Transform 到什麼 E. coli strain？
推 Nicoleching: 這時候我會改用Gibson去做...