[求救] H1299肺癌細胞養不起來

[zzxc87520 (珼珼)]

大家好
目前解凍後的H1299肺癌細胞
一直養的不是很理想
這邊列出步驟跟細胞的狀況
想知道問題到底出在哪裡


使用的medium 是 DMEM+sodium pyruvate

步驟
1.細胞從液態氮取出後立即解凍直接放進medium 中
medium 我大概是用10-15cc在dish
2.確認一下有均勻分布後就直接放進培養箱
3.隔天會換medium 大約7-8cc （會用PBS清洗）

細胞狀況
1.貼壁的情況不是很好，有很多細胞會飄起來。
2.本以為是可能原本細胞凍太稀，所以後來是用
6公分的dish把細胞液分兩盤養，medium 是4-5cc,再加0.5cc細胞液，但情況差不多，有貼但也很飄，可是medium 沒有變色也沒有混濁。
6公分的dish把細胞液分兩盤養，medium 是4-5cc,再加0.5cc細胞液，但情況差不多，有貼但也很飄，可是medium 沒有變色也沒有混濁。
3.解凍的隔天我會看一下細胞的狀況，但常常看到有一點一點的黑色碎屑在細胞旁邊，不太確定是什麼東西，仔細看會感覺有在跳動，晃動dish的時候碎屑不太會移動。
4.H1299聽學姊描述是會展開有點像神經細胞的樣子，會有角的，我解的細胞有展開但很多都是圓圓的，但不是全部都會飄。



之前解凍第一管沒長好
我後來看medium中有白色的漂浮物
所以有換過medium
解第二管的時候情況也沒有好轉
所以我覺得不是medium的問題
（我有test新的medium 但沒有長東西）
可是每次隔天看細胞都還是有黑色碎屑
我不確定是污染還是寄生蟲
或是只是代謝物


手法的部分，我覺得我滿輕巧的
都是吸出後直接加進medium 裡
而且還是輕輕的注入

如果是凍管本身的問題我該如何處理好呢
我已經解了大概4管都長不起來
我已經解了大概4管都長不起來
我也不太動他怕他長不好
大概兩天看一次

學姊說他之前有養成功
讓我更挫折
我找不到原因在哪裡害我很慌張

我有養另一株肺癌細胞A549
這株學姊說比較好養叫我先做這株
養的也蠻順利的已經culture 很多代了

但對H1299始終沒有辦法

請大家救救我感謝大家

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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1525362258.A.EDB.html
→ roy047: DMSO 有洗掉嗎？
推 tynse71864: 聽起來是凍壞或污染？ 後者不太有救…
→ tynse71864: 血清是哪個等級的?
推 joseph103331: 或許是凍壞，碎屑可能是死細胞碎片，會影響細胞生
推 joseph103331: 或許是凍壞，碎屑可能是死細胞碎片，會影響細胞生
→ joseph103331: 長，如果有部分貼附可以考慮置換medium，等到細胞
→ joseph103331: 群長起來再打散繼代
→ Medical: Medium回溶以後會離心去DMSO 再丟進去dish 隔天再換一次
→ Medical: medium 確保DMSO移除
推 o81628: 我之前解凍DMSO沒有移除，H1299照樣長，也許不是這個問題
推 steve42125: 聽起來比較想凍壞耶   凍在哪凍多久?
→ steve42125: *像   個人也是養A549跟H1299   這兩株應該都算是生命
→ steve42125: 力強又好養也不太漂的
→ Sylvaine: 你們H1299是用DMEM養？我以前是用RPMI1640養，不曉得有
→ Sylvaine: 沒有差？
→ Sylvaine: 不過如果實驗室長期以來用DMEM養都OK，有沒有可能是凍
→ Sylvaine: 壞了呢？
推 qaz01817: 我能借題 問一下 什麼是凍壞了?
→ qaz01817: 是指凍細胞的流程出問題?還是細胞保存的過程有問題?
推 tynse71864: 樓上說的都有可能； 凍的時候降溫過快，回溫解凍不夠
→ tynse71864: 快，加入的 DMSO不足量等等
05/05 16:25
先感謝各位的回覆，我沒有洗掉DMSO，我是直接加入medium隔天再用DPBS洗，然後換新的medium。
細胞是凍在液態氮裡是2017/07/26凍的，同一桶裡的細胞學姊也常在解凍其他細胞，應該不是液態氮桶的問題...嗎？
凍管是大學姊凍的，我上一屆的學姊有說他覺得H1299比A549難養，可是大學姊跟我上一屆學姊說他們養的起來嗚嗚嗚，我覺得好挫折。

這邊想問一下各位大大，如果先離心去除DMSO的話會比較好嗎？這個步驟會算是回溫不夠快嗎，我一直不敢嘗試，因為大家都建議要1分鐘內回溫。
※ 編輯: zzxc87520 (110.50.175.86), 05/06/2018 00:56:04
推 tynse71864: 放37度水浴槽到凍管快溶即可;後離1000rpm 3min，吸去
→ tynse71864: 上清回溶到 medium裡。
→ tynse71864: 有時候沒離掉細胞飄很慘@@
→ blence: classroom.bcrc.firdi.org.tw/home/cell/cell_thrawing
→ blence: 除非體積太少,冷凍細胞在1分鐘內就回溶比BCRC預估時間還快
推 joseph103331: 自己做的時候1mL實際回溶時間大概在1~2min左右
→ blence: 多數癌細胞也不需回溶時除去DMSO,隔天換medium還比較好
→ bj59420: 之前養1299跟A549都覺得很好養，不過我也是用PRMI
推 david31408: 凍壞了  看有沒有更早之前的passage
→ david31408: 我之前有養過MDCK 發生過一樣的事情  但我的細胞會長
→ david31408: 長得比之前的慢 黑色碎片會變多
→ david31408: 換早期一點的代數重新解凍養就行了
→ steve42125: 抱歉 同為H1299有問題想借串發問請教培養經驗
→ steve42125: 我在Trypsinize時會放incubator 每2 3分鐘會輕拍然後
→ steve42125: 觀察  但是發現常常細胞雖然已經全部都有飄起來 但都
→ steve42125: 會有小小聚成團的方式  離心打散pellet種下去還是會有
→ steve42125: 想請問有人有沒有解決的經驗或建議的解決方式  感謝!
推 SherryKu: 有沒有可能是打得不夠散？先以1-2mL打散均勻之後再種看
→ SherryKu: 看呢
→ steve42125: 我都是用1ml的medium打散  但感覺還是會稍微有點小團
→ steve42125: 才想說有沒有其他的選項可以嘗試XD
推 joseph103331: 在pellet的時候可以先敲散 然後再加medium打散
→ steve42125: 這招我倒是沒想到  謝謝建議!XD
推 ChesterYeah: medium 先回溫到37度，加到盤子裡。
→ ChesterYeah: 細胞凍管迅速回溫，然後滴入medium
推 ChesterYeah: 過8小時去搖搖盤子看貼了沒，貼了之後立刻換medium，