[求救] Linker活化、EDC/NHS、antibody鍵結問題

[j67897 (E-sou )]

大家好，小弟想問一下Linker活化、並鍵結抗體的相關問題

先簡述我的實驗步驟：

1.在金層上利用Au-S 鍵結SAMs層(使用Linker為8-巯基辛酸)，末端為COOH
2.利用EDC/NHS活化Linker
3.滴定抗體使抗體鍵結於Linker上。


爬了版上另一篇詢問的文章以及學長論文得知
EDC和NHS是活化COOH基用的，EDC先和COOH基反應，然後再由NHS和這個基團反應，
:: 最後變成 R-C=O -NHS的反應基團，接下來就可以和帶有 R2-NH2的基團反應
論文中是寫EDC/NHS改質Linker的羧基COOH，使其易與抗體的胺基產生肽鍵。

如果以上沒錯的話代表Linker是與抗體的NH2反應，可是抗體的NH2鍵長在Y字型的
上面兩個點，那裏同時也是抗原進行專一性鍵結的地方，
這樣不就代表抗體應該是倒插在我的SAMs層上嗎?，為什麼文獻都是畫正的Y呢?

目前的猜想是所謂的NH2只是抗體重鏈中的某個側鏈，而不是Y頂端的抗原結合點

沒有生物化學背景來這邊問問題商大家的眼睛了抱歉，
煩請大大願意耐心幫我解答一下，謝謝

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推 hihijoker: 隨機方向鍵結到SAM
→ j67897: 所以的確是與抗體中的NH2鍵結，但是是隨機方向的NH2囉?
推 shmin: 抗體上有太多可以反應的地方
推 Ianthegood: 隨機插上所有的N-ter跟lysine/arginine的side chain
→ Ianthegood:  當然機率是一個 構型也要考慮
→ j67897: 那文獻中抗體都是Y字型插在表面只是方便示意而以囉?實際上
→ j67897: 不一定是這個方向
→ j67897: 想在請問一下除了螢光外，有什麼方式可以確認抗體OR抗原
→ j67897: 有佈植上去呢? 單純顯微鏡可嗎?目前是想用XPS看表面元素
→ Ianthegood: 顯微鏡可以啊 跑一張IF
推 ChesterYeah: EDC NHS 就是做amide bond形成在用 主要形成diimide
→ ChesterYeah: 再被有親核劑攻擊 形成新的bond
→ ChesterYeah: 簡單說就是可以加快反應用的
推 MDCCLXXVI: 隨機接 所以會東倒西歪 Y字型朝上只是好看用的
推 NSB35573: 定性的話，可以用 cd spectrum 去測你純化後的產物有沒
→ NSB35573: 有抗體的訊號。
→ NSB35573: 另外，如果你做的東西是particles,粒徑至少要大於50~100
→ NSB35573: nm，可先利用EDC/NHS有螢光的抗體接上後，再用confocal
→ NSB35573: 顯微鏡看螢光影像。
→ NSB35573:
→ NSB35573: 要定抗體接上去的量，用protein assay，例如Bradford as
→ NSB35573: say。
→ NSB35573: 然後這反應很毒..