Re: [求救] H1299肺癌細胞養不起來

[zzxc87520 (珼珼)]

※ 引述《zzxc87520 (珼珼)》之銘言：
: 大家好
: 目前解凍後的H1299肺癌細胞
: 一直養的不是很理想
: 這邊列出步驟跟細胞的狀況
: 想知道問題到底出在哪裡
: 使用的medium 是 DMEM+sodium pyruvate
: 步驟
: 1.細胞從液態氮取出後立即解凍直接放進medium 中
: medium 我大概是用10-15cc在dish
: 2.確認一下有均勻分布後就直接放進培養箱
: 3.隔天會換medium 大約7-8cc （會用PBS清洗）
: 細胞狀況
: 1.貼壁的情況不是很好，有很多細胞會飄起來。
: 2.本以為是可能原本細胞凍太稀，所以後來是用
: 6公分的dish把細胞液分兩盤養，medium 是4-5cc,再加0.5cc細胞液，但情況差不多，有貼但也很飄，可是medium 沒有變色也沒有混濁。
: 6公分的dish把細胞液分兩盤養，medium 是4-5cc,再加0.5cc細胞液，但情況差不多，有貼但也很飄，可是medium 沒有變色也沒有混濁。
: 3.解凍的隔天我會看一下細胞的狀況，但常常看到有一點一點的黑色碎屑在細胞旁邊，不太確定是什麼東西，仔細看會感覺有在跳動，晃動dish的時候碎屑不太會移動。
: 4.H1299聽學姊描述是會展開有點像神經細胞的樣子，會有角的，我解的細胞有展開但很多都是圓圓的，但不是全部都會飄。
: 4.H1299聽學姊描述是會展開有點像神經細胞的樣子，會有角的，我解的細胞有展開但很多都是圓圓的，但不是全部都會飄。
: 之前解凍第一管沒長好
: 我後來看medium中有白色的漂浮物
: 所以有換過medium
: 解第二管的時候情況也沒有好轉
: 解第二管的時候情況也沒有好轉
: 所以我覺得不是medium的問題
: （我有test新的medium 但沒有長東西）
: 可是每次隔天看細胞都還是有黑色碎屑
: 我不確定是污染還是寄生蟲
: 或是只是代謝物
: 手法的部分，我覺得我滿輕巧的
: 都是吸出後直接加進medium 裡
: 而且還是輕輕的注入
: 如果是凍管本身的問題我該如何處理好呢
: 我已經解了大概4管都長不起來
: 我已經解了大概4管都長不起來
: 我也不太動他怕他長不好
: 大概兩天看一次
: 學姊說他之前有養成功
: 讓我更挫折
: 我找不到原因在哪裡害我很慌張
: 我有養另一株肺癌細胞A549
: 我有養另一株肺癌細胞A549
: 這株學姊說比較好養叫我先做這株
: 養的也蠻順利的已經culture 很多代了
: 但對H1299始終沒有辦法
: 請大家救救我感謝大家



先前有在板上詢問過H1299的問題
但沒辦法用留言回覆各位
所以再發一篇，也跟大家講一下目前的情況

後來我有嘗試把DMSO去除，細胞就有貼附了
而且型態蠻漂亮正常的

但是遇到另一個問題
細胞不會長
感覺上就是沒有在增生
然後就慢慢的死掉了
我本來以為是可能要給他點時間
所以我每天可能打開培養箱看一下
如果培養液的培養液的顏色沒有改變
我就也不會動他
我就也不會動他
第三天會換培養液
細胞不會飄很多起來
但就是很明顯的沒有在長
然後慢慢的細胞越來越少
後來可能我操作上有問題不小心污染了
我就丟掉了

之後跟學長求救
學長也是一樣的情形
但學長是剛解凍後正常生長
但繼代一次之後細胞就不貼壁了

各位覺得會是什麼問題呢
我其實沒有頭緒
也想不太出來到底是哪裡出問題
凍管都是一樣的沒有道理學姊養的起來
但學姊不太想幫我養細胞
所以目前還沒有麻煩他

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 1.200.49.239
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1527793861.A.659.html
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1527793861.A.659.html
推 tynse71864: 我家凍壞的 MEF也是這樣 QQ
推 qiet: 看ATCC是用RPMI1640在養的 看要不要試試 但我覺得是凍壞了
→ qiet: 難道沒有細胞剛買來第一批的凍管可以解嗎
我們家這株細胞是跟其他實驗室要的，我試試看能不能再要到一批，但真的很希望不是凍壞啊啊啊啊啊
※ 編輯: zzxc87520 (1.200.49.239), 06/01/2018 10:58:52
→ Sylvaine: 覺得1. 可以考慮換用RPMI養2. 做好重新要一批的心理準
→ Sylvaine: 備。當然也可以不死心繼續解其他凍管直到OK或耗盡為止
→ Sylvaine: 。學姊之前養得起來不代表現在一定也養得起來，尤其是
→ Sylvaine: 你們又是拿後來凍的，狀況早就不同了。
推 MIWAKO2014: 用RPMI養。
推 Medical: 覺得凍壞的........
推 joseph103331: 汙染不會逐漸死亡啦...很快就死了