[求救] 想請問96 well細胞如何種均勻和一些操作

[steve42125 (DrunkenBlue)]

如題
最近常常在使用96 well plate做細胞實驗
剛種下去在顯微鏡看的時候好像沒什麼異狀
但是幾天後發現well中的細胞都是圍著well長一圈
沒有均勻的分布長滿
看起來就像中間破洞一樣
甚至有幾格看起來好像根本沒有種到細胞

稍微描述一下我在操作時的方法
請求各位指教與指正

調配好比起需要的量在多一些的細胞液
之後以100ul的pipette吸取細胞液
目測tip尖端大約會在液面下3~5mm位置
之後tip抵著邊緣加入細胞液
(這個動作我都不會壓到二段，因為壓出氣泡會把細胞擠到旁邊，求解決)
加完後不會搖晃或拍打，會直接放到incubator

在需要refresh medium的時候會把plate稍微傾斜
以八爪抵著well的角落底部將medium去乾淨
在將plate往另一個方向傾斜後一樣以八爪抵著well的側邊加入新的medium

以上是我大略的操作手法

上了研究所才開始接觸細胞實驗
很多技巧都還在努力摸索
想在這邊請教比較有經驗的各位
在操作上是否有什麼技巧或著是我可以試著改進的地方
感激不盡

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推 shinink: 吸2段吐一段呢？
您的意思是說用reverse pipetting的方式嗎?  其實我有想過這樣做
只是我想說  因為多吸的那一段細胞液中的細胞會在tip中下沉
會不會吐一段的時候變成多吐了一些來自那些多吸的細胞液中的細胞
還是沒這麼誇張XDD
※ 編輯: steve42125 (1.161.30.96), 06/10/2018 22:32:18
※ 編輯: steve42125 (1.161.30.96), 06/10/2018 22:36:00
推 qaz01817: 個人會以8爪直接加下去 可抵well可不抵 然後壓兩段到底
→ qaz01817: 產生氣泡我是沒影響 我會在多pipet幾下 前後左右piepet
→ qaz01817: 。以最後生長狀況來說 是很均勻
→ qaz01817: 但詳細還是要看你下多少細胞 幾天後收他 以及你用的細胞
→ qaz01817: 生長速度等狀況 這都會影響
先謝謝您的回覆
不過我很好奇的是  在well中pipetting不會有氣泡嗎?
我光是二段下去就會有一顆大泡泡了XD
我之前也想說氣泡在放到incubator之後應該會自己破掉
可是他好像已經害我的細胞在貼盤前就被擠開了
※ 編輯: steve42125 (1.161.30.96), 06/10/2018 22:58:10
※ 編輯: steve42125 (1.161.30.96), 06/10/2018 22:59:09
推 qaz01817: 個人經驗是氣泡會有 氣泡之後會破掉 而造成的影響不大
→ qaz01817: 當然你下的細胞少 然後可能24小時就收 當然會有影響
→ qaz01817: 所以還是要看你的實驗設計
→ qaz01817: 然後擠開的問題 我在well中pipet 產生的氣泡會均勻存在w
→ qaz01817: ell中 不會只產生單一氣泡 所以擠開的問題我是都沒遇過
了解了  謝謝您的經驗分享  我會再根據我的實驗思考一下使用時機!~
※ 編輯: steve42125 (1.161.30.96), 06/10/2018 23:43:11
推 allisa: 盡量不要有氣泡 我會抵著well壁加下去 動作盡量快點 然後
→ allisa: 配好的cell我是放在儲液槽裡用八爪加 加完不要搖也不拍直
→ allisa: 接放incubator 基本上很均勻
Hmm.... 可能是我加下去的時候動作不夠快讓medium繞著邊邊進去
所以細胞都堆在邊邊了
謝謝你的經驗分享!  我會試著改進的~
是說  把細胞液到進儲液槽的時候有需要晃動儲液槽讓它均勻嗎?
還是直接給它整個tube倒下去他們自己會平均分布XD
※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 06/11/2018 19:12:42
※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 06/11/2018 20:23:57
推 marvelous13: 試試換另一家的plate,有時候是該品牌的問題
推 rainbowcatch: 種完細胞後放在搖擺機上輕搖晃
推 michealking: 種完要搖一下吧？