[求救] lentivirus dual infection

[tynse71864 (TATA box)]

各位版大好:


我目前想送兩個螢光fusion protein進去Jurkat T cell 裡面

拍live imaging (一個接GFP, 一個mCherry)

目前是送進去的方法有一些問題:

1.利用電轉染   2. 利用lentivirus



電轉染之前測試的結果  發現兩者同時送入細胞的比例不高，大概10%

(可能是條件沒用好電的效率太差，單就轉染效率粗估30%，我是用Biorad-Xcell)

就算有，兩者皆表現適中，適合拿來拍live的幾乎是沒了

而且每次電都要極大量的plasmid

所以目前是傾向用lenti去感染 (至少目前用起來效率較佳，表現較平均)


但目前手上只有一個lenti ovexpression vector (CMV drive的, puro resistent)

我想問說，如果我把兩色的construct都分別接入這個vector

再去感染細胞 (sequential 或同時感染)

應該會導致其中一個表現量被競爭掉?

我是否需要兩種不同promotor drive的vector呢? 還是其實不太影響?



而且同一種vector代表我無法用抗生素篩出同時表現GFP/mcherry的細胞

這也是有點為難的點...

只是中研院的pLAS系列爬以前的文，看起來titer有點低，不知是否該買下去



補: 我的cDNA+螢光蛋白大小:

Target protein是3.5k

作為marker protein的序列為1.5~2k不等，但只有一個5.2k的marker

我有點不確定virus能不能送進去




各種的建議都可以 (或是電轉染相關的建議也行)

小的第一次處理T cell，以前養Hela最常用transfect的lipo直接掰掰

有缺的資訊我會盡快補上，還請大家多多提點，謝謝!

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推 ampicillin: 用2A peptide接起來 不然IRES也可以
推 wang7514: 也可試試flow sorting那些double positive cells
推 july81212: IRED一票
→ july81212: IRES XD  用lentivirus dual infection 之前做效果沒
→ july81212: 有說很好
推 joseph103331: IRES+1
→ joseph103331: Dual infection的話就還是要兩個不一樣的抗生素，
→ joseph103331: 自己改也可以
→ xxtomnyxx: 不推IRES，除了不同細胞表現效率不一樣的問題外，也不
→ xxtomnyxx: 太能控制前後ORF的表現比例，推薦2A，可以確保 1:1 的
→ xxtomnyxx: 表現量。你可以 A-EGFP=2A=B-mCherry=2A=PuroR 這樣
https://imgur.com/a/AMu5YH4

圖片是我的Plasmid map

先謝謝大家的建議，但由於手邊的plasmid IRES2後已經接了puro，也沒有其他切位
硬要塞成我的B fusion protein感覺有點難

2A peptide我會研究看看；不過這樣子plasmid總長度會到12k左右
會不會先卡在抽plasmid這步驟囧

另外這樣大的fusion protein不會影響到virus 的效率嗎?
→ turtle24: lenti可以裝更大的
→ xxtomnyxx: 用 NheI/AgeI 切開 plasmid，把 B-mCherry-2A 塞進去，
→ xxtomnyxx: 2A的序列只有 60 bp 左右，可以直接加在 primer 上
→ xxtomnyxx: 我會建議在 A 和 B 兩個 fusion 蛋白上裝 tag，方便用
→ xxtomnyxx: 於檢查 2A cleavage 效率以及日後如果要檢測蛋白質表現
→ xxtomnyxx: 時可以用。
推 joseph103331: 12k不會影響抽DNA啦, Bacmid 170k都在抽了
→ joseph103331: 他的mCherry跟GFP就是tag可以檢查囉
→ joseph103331: 2A的影響會有需要排除嗎?
→ xxtomnyxx: 對吼EGFP和mCherry就能用抗體認了...我這裡連EGFP都是
→ xxtomnyxx: 用myc在做western所以沒意識到XD。一般來說2A主要就是
→ xxtomnyxx: 要檢查cleavage的效率，2A本身序列很短就像tag一樣基本
→ xxtomnyxx: 上可以忽略。
推 johanjohan: IRES+1
推 MDCCLXXVI: 2A效率不太好
→ MDCCLXXVI: 切的效率  所以要注意也沒有沒切斷的
抱歉假日比較有空回:

X大的建議不錯我會試試看; 至於2A跟IRES目前上網找看好像各有利弊
(前者不一定切的段/後者表現量比較飄)

IRES由於切位實在生不出來，而且還要把puro搬家
不是很想把事情弄那麼複雜囧

→ saviora: 先轉一個再sorting 接著再轉第二個 再sorting
推 joseph103331: 如果有flow可用,也不用想篩藥的問題了
→ joseph103331: 兩個一起感染,sorting出滿意的雙螢光細胞即可
→ joseph103331: 後續還是篩藥,只是拿來保持細胞株用
近期會去學flow，只是我們所上也沒有，得去別人家借
這也是一個比較麻煩的地方

是說我想請問一下，我用lenti infect成的polyconal cells
理論上持續用puro篩藥，就能維持ovexpression gene的表現量了吧?

(就不會篩一篩螢光全沒了...我是指細胞沒養太久的情況下)
※ 編輯: tynse71864 (103.224.203.107), 06/30/2018 10:13:38