[求救] 請教IP-Mass後的Co-IP驗證

[ararthur (RAYPTT)]

大家好 這裡有一些與Co-IP、protein-protein interaction的問題想請教

我們以IP-Mass Screen出一些欲研究蛋白"X" 之interacting protein candidates後
(Y1.Y2.Y3...)

再使用Co-IP重複驗證X與Y們的interaction

發現如果IP下X的immunoprecipitates 能夠以Western blot偵測到 X Y1 Y2 Y3等的存在

但是反過來分別IP Y1 Y2 或Y3時 卻都只能偵測到他們自身的存在 而無法偵測到X
(使用IP用Ab或另一隻anti-X Ab都無法偵測到)

請問這樣的情況應該如何解釋？ 或是說單向IP的證據就已足夠？

第一個想法是量的差異
如果X可以結合10個蛋白其中一個是Y1 而Y1可以結合1000個蛋白其中一個是X
那自然抓下X容易偵測到Y1 可是反之卻不然

第二個想法是Ab-Ag在IP過程中conformation改變
進而影響結合蛋白情況 但這相當難以實驗證實

最後 我也有猜測X的Ab專一性太低 抓到許多非X的雜蛋白 所以才偵測到false positive
但若是這種情況 IP下 Y1 Y2 Y3 仍然應該可以用anti-X去偵測到才對(?)


PS1 我們IP的target都是endogeneous protein，細胞均未處理/未overexpress
PS2 IP-Mass的結果是重覆兩次相同實驗後取交集而來
PS3 IP過程均有做Posi/Negative control (Whole lysate, beads only, IgG isotype)
PS4 IP與WB都是用同一隻抗體

有任何資訊不足的再請提出 非常謝謝大家

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.121.122
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1530847751.A.A04.html
※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 07/06/2018 11:56:00
推 tynse71864: IP a抓到 b ,不代表反過來做就會成功，必須考慮IP用抗
→ tynse71864: 體的epitope; 尤其你又是 endogenous protein
→ tynse71864: 可能你b抗體認的位置就是 他跟 a interact的位置,那你
→ tynse71864: 怎麼抓也都只有 freeform的 b而已
推 tynse71864: 可能染個 IF或 用293t o/e 接 tag的蛋白去證明吧，真
→ tynse71864: 的要的話
謝謝 請問染IF是看 co-localization嗎?
※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 07/06/2018 11:59:34
推 tynse71864: 嗯嗯沒錯，我那時是做到單向 IP跟染色;  想做更細一點
→ tynse71864: 也能做 GST pulldown assay，但這也未必會成功就是了
→ tynse71864: 。
推 july81212: 還有可能是Y1,Y2是beads或resin contaminants 並不是
→ july81212: 真的interaction...
推 july81212: sorry 沒看到你的PS3 不過正常Co-IP 驗證會OE 所以第
→ july81212: 一點不太會發生
推 july81212: 另外T大講的事件容易發生在小的蛋白上 除了改pulldown
→ july81212: 嘗試外 也可試試純化（小tag或不帶tag)crosslink 後跑
→ july81212:  PAGE 或跑SEC看有沒有peak shift (之前做～15Da IP或
→ july81212: pulldown 常發生 blocking 的現象）
謝謝J大回覆
可是我的X蛋白~80KDa Y蛋白們則在40-90kDa
其中X蛋白用的IP 抗體是polyclonal Y蛋白大部分是monoclonal(Brand=CST)

說到Size exclusion chromatography 我之前試圖做過lysate直接跑SEC (Akta)
fractions拿去測X蛋白的位置 發現X大約出現在相對MWCO>=440KDa的時間點
所以才非常想知道那麼大的complex裡面藏了什麼

推 tynse71864: J大： 沒錯我兩個蛋白剛好15跟25kDa,做起來超崩潰qq
→ tynse71864: 還會卡 light chain
→ blence: 我覺得會拿來做IP-mass,就至少對抓的效率(%,對比input)有
→ blence: 信心,只是Y1,Y2抓的效率差,就只剩IP自己,看不到coIP蛋白了
→ blence: 而且我自己經驗WB最強跟IP最佳常不相同,如果一定試到底,
→ blence: Y系統抗體有需要找IP能抓更多的來試
報告B大 其實我覺得我們的實驗中
對於input lysate amount來說 X蛋白的IP抓下來的比例並不是很高耶...(慚愧)
送去做Mass 純粹是我們真的太想知道X的interacting protein有哪些的粗暴方式
不過做了兩次IP-Mass 重複出現的比例還蠻高的(有扣除Negative ctrl的 noise)

雖然我知道WB會放大訊號 得到的訊號也只是相對值
但是IP 幾個Y蛋白後 WB偵測到他們自己的量還蠻高的 甚至有一個還燒band(過量)了
(~100ug lysate as input) 抓到的效率% 要等我到Lab時看看
我會再考慮其他可用的抗體 或是測看看其他interacting protein candidates

另外有個延伸IP-Mass的問題想詢問
IP-mass抓下來的蛋白 我們挖了兩條相對於negative ctrl多出來的band去打mass
扣除掉相對位置的IgG isotype control的結果後 還出現數百個蛋白 是常見的事嗎？
因為實不相瞞 即使從兩次independent IP-mass抓下來交集的蛋白種類都超過150種了...
有點覺得太多XDDD

推 Ianthegood: yeast 2 hybrid?
推 Ianthegood: 驗證也是MS嗎?
I大您好 之前也有考慮過Y2H
不過曾聽過作Y2H的實驗室透露Y2H和IP-Mass screen interacting protein時
常會出現蠻不一致的結果 但Y2H的確和IP的機制不太一樣
結果就沒有嘗試了 就您的經驗 用Y2H去驗證protein interaction有效率嗎？


謝謝各位的回覆^^
※ 編輯: ararthur (36.230.227.43), 07/07/2018 01:12:48
推 tynse71864: y2h 幾乎是要重新建立一個新系統欸
→ tynse71864: 看你究竟對 Y123是怎樣的研究興趣耶;如果是抓可能的 i
→ tynse71864: ntx protein來研究 X的功能, 補個 tag o/e IP 的實驗
→ tynse71864: 比較快也較接近實際狀況 (可還能看 Y123是否跟 X形成
→ tynse71864: complex)
推 july81212: 1D PAGE一條band打到上百還算正常
→ july81212: 另外IP用 polyclonal 很容易抓到False positive 建議
→ july81212: 在ID時拉高criteria 話說妳如果要問complex 為何不直
→ july81212: 接 purify complex直接打MS 配合IP這樣不是比較直觀嗎
→ july81212: XD
推 july81212: 可以直接crosslink->purify complex(SEC/IP)接MS
推 joseph103331: 我覺得做pulldow跟帶tag的co-IP比較好
→ joseph103331: endogenous association可以交給IF來判定
→ joseph103331: 如果覺得IF不夠好,也可以試試看FRET
→ joseph103331: 不過我們是習慣把結合位去除再來看位置判斷居多
推 joseph103331: 帶tag的實驗也可以驗證抗體會不會block你的訊號
→ Ianthegood: 忽然想到 也許y3是secondary binding 假設是y1 y2的co
→ Ianthegood: mplex才抓得到y3?
→ Ianthegood: 我是覺得你control有做好 單向就可以發了啦 甚至可以
→ Ianthegood: 把反向抓不到也寫進results