[求救] 切膠純化後還是有雜band

[shokugeki (食戟)]

大家好
現在我在用pfu pcr擴增一個片段。用的酵素是Agilent的PfuUltra II Fusion HotStart
DNA Polymerase；template是之前建構好的plasmid，每一次下的濃度約700ng/ul；prime
r長度是60mer(之前是拿來建構plasmid用的，所以有點長)。pcr後跑膠除了主要band(137
8bp)外，在2.5～3k的地方出現了不明顯的雜band，之後切膠純化主要band後再跑膠確認
還是有雜band。
為了除去雜band，我試著把pcr annealing溫度提高、extension秒數縮短讓它最大只能做
到2k，但都不行。
也有把水當template來跑跑看，結果是什麼band都沒有。
想請問各位這是發生什麼事了？有沒有方法能除去雜band呢？


感謝各位

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→ blence: 700ng/ul,做出來的PCR產物應該也沒這麼多
→ Ianthegood: 重做primer 要過膠純化
→ xxtomnyxx: 我猜那個雜band是你的template
推 mtcoat: template是之 前建構好的plasmid為何要用到700ng/ul? 我
→ mtcoat: 整個反應都只加10ng 另外primer建議重新設計長度在20-23 n
→ mtcoat: t即可
推 Nicoleching: 切膠完之後再跑膠又在2.5-3kb出現一模一樣的雜band?
→ Nicoleching: 會不會是你產物的2或3級結構？