[求救] 透析後的純化蛋白BCA定量問題

[ararthur (RAYPTT)]

有關蛋白純化/透析/蛋白定量的問題想請教，

我自行純化的純化蛋白X 在透析前以BCA定量，

測定出來的濃度在 56.5 ug/ml；

以Thermo SnackSkin透析膜(10k MWCO) Dialysis後再以BCA定量，

測定出來的濃度卻高達 1100 ug/ml，

請教有什麼可能能夠解釋出現這種狀況嗎？

非常感謝！


PS1 原Sample buf condition = 25mM Tris-HCL, 100mM Glycine pH未知

PS2 蛋白純化過程的buf如下
    Elution buf= 1ml of 100mM Glycine (pH 3.5)
    Nutralization buf= 25ul of 1M Tris (pH 8.0)

PS3 Dialysis buf condition = 25mM Tris-HCL, 100mM Glycine (pH 7.3)

PS4 由於buf condition是相同的，透析前後體積未劇烈變化

PS5 透析前後BCA呈色狀況不同(前:淡藍綠色 vs. 後:類似stanard的紫色)，
    如圖所示 https://imgur.com/YVeFpiy

PS6 兩次BCA的 R^2 均>0.996




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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.121.122
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1531975146.A.1B1.html
推 joseph103331: 看起來很像透析前的buffer影響的喔
推 duriamon: 有可能影響BCA定量的干擾物被你用透析去掉了。也可以確
→ duriamon: 認一下BCA定量的compatible table看看使用的buffer會不
→ duriamon: 會影響。
謝謝，另外我有測Sample與Dialysis buf的pH值，都是相近的中性(用試紙測試)，
重做一次BCA，也是一樣的結果，
我來找看看BCA定量的資料，是否Buffer或其他干擾物有可能造成此現象。

推 chenmick: 你透析幾次？每次體積多少？
您好，透析兩次各兩小時，Sample體積2.5ml，Buffer體積500ml。

→ NSB35573: 蛋白質樣品用透析方法很容易染菌
→ NSB35573: 另外protein assay 會被四級胺影響,例如0.1M的Glycine或
→ NSB35573: CTAB等等。
您好，透析過程我都將燒杯至於冰中，理論上應該是不會菌的汙染才是
謝謝，但我是推估前後sample的buf是一樣的，所以還在想到底哪一項沒估算到@@

推 chenmick: 會不會純化前有還原劑，SDS或金屬螯合劑？
謝謝回覆，有猜測，但理論上在純化過程時應該已經被沖洗掉了，
我會試著用不同的蛋白定量方試看看，
會先試看看Bradford assay，再上來跟大家報告，謝謝大家的回覆。
※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 07/20/2018 10:44:58

今天用Bradford assay 測定Dialysis前後的蛋白濃度，
令人訝異所測到的濃度相仿，看來BCA assay並不適合我的重組蛋白...

另外以Coomassie Blue R250染出來的band 透析前後也是差不多，
Coomassie Blue system (包含Bradford)似乎比較合適。

謝謝各位參與討論 <(_  _)>
※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 07/20/2018 14:39:46

補充一下，後來我使用BCA protein assay 將reagent B提高3x (Cu2+濃度提高)
便可以讓dialyzed protein呈現與undialyzed protein相仿的濃度了!
看來是dialysis影響了Cu2+的還原了...但原因仍未解

提供一些經驗供大家參考 再次謝謝
※ 編輯: ararthur (36.229.11.1), 08/13/2018 00:52:43