[求救] RNA去除gDNA的方法

[yaliu (雅)]

大家好，最近在抽乳酸菌的RNA，但總是會有gDNA的汙染，

因為後續要做QPCR，原核生物也無法用引子避開DNA的汙染的問題。


我是用Qiagen的抽RNA kit，也買了DNase做on-column或者elution之後gDNA的去除，

但總是去不乾淨.....>"<

都改成37度反應30min了還不行(kit是建議20-30度10-15min)，

跑電泳是看不到gDNA那條band，但我將RNA直接PCR 16S基因就是有band，還頗亮.....

已經不知道要改什麼了....


另外，kit是說建議菌量<1e+9 cfu，

可是我使用這個菌量下去萃RNA濃度就是很低阿，10-20ng/ul(最後只elute 30ul)

所以只能提高菌量，有人一樣用這個kit萃這種菌數可以得到很高濃度的RNA嗎??

當然因為實驗的關係我是抽stationary phase的RNA，不過有可能低成這樣嗎??

另外培養基很複雜，不是那種MRS養的..

破菌是採用bead的方法，還是用lysozyme會比較好??



請問有沒有人抽G(+)細菌RNA然後沒有gDNA的污染的，

是用什麼方法抽的??如果是用kit的最好，感謝大家!!!


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 118.163.159.117
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※ 編輯: yaliu (118.163.159.117), 08/16/2018 12:02:07
→ ernielwl: 我之前也用Qiagen家的RNA kit抽真菌,確實On-column的除
→ ernielwl: 不乾淨
→ ernielwl: 好奇的是妳看不到gDNA的band,那16s 23s 5s都清楚嗎
16s 23s看的到，5s很淡幾乎沒有
不過直接PCR 16S還是很亮，
上qPCR CT值還是20幾...
所以跑膠看有沒有gDNA汙染看起來也不太可信，
還是PCR最準!!

→ ernielwl: 如果kit不行是建議換Trizol,用分層的污染會少很多,過col
→ ernielwl: umn多少都會殘留
想說trizol是最後一步

→ huuban: 用Trizol抽回收量應該有機會column高吧
→ huuban: 我們實驗室有時候DNase會吃兩趟，給您參考
沒錯，我最後也是吃兩次才"比較乾淨"，
PCR很弱band,
qPCR看不到(有稀釋成假設轉cDNA要上機的濃度)，
不過我是做兩次的on-column,
等於就會再浪費一個column了，
想要試試可不可以反應第一次後離掉，
直接再加DNase反應第二次...
(都做兩次了PCR還有弱band是怎樣...)
推 lingon: trizol 最乾淨, 抽完再用DNase, DNase 用的次數也不要太多
→ lingon: 用多了還是會影響RNA quality
推 Ianthegood: turbo dnase, $$$, 但是比較強
→ Ianthegood: trizol比較高應該是總量超過column的capacity是才明
→ Ianthegood: 顯吧
→ a90648: 我們LAB有些人是Trizol分層後再用column
業務有提供另一款RNAeasy plus的，
也是類似trizol分層，但是是期貨，
想說如果真的要花掉兩個column就要改買這一組了...
※ 編輯: yaliu (223.138.123.221), 08/17/2018 18:30:03
推 michealking: trizol 產糧比較高 要clean再過column
→ michealking: 另外不可以多樣品混合嗎？
→ TigerDuck118: 弱弱問一下 16sRNA本來就超濃 然後PCR看的到
→ TigerDuck118: 表示仍有gDNA污染 是一定的嗎?
推 ernielwl: 回樓上,你要一個做對照組,如果超濃你下去當template的量
→ ernielwl: 也許就會看得到band,然後理論上用oligo dT primer做成cD
→ ernielwl: NA是p不到rRNA的,但是RNA quality很好的時候我個人經驗
→ ernielwl: 還是會p到rRNA,如果是真核生物比較好解決找一對含intron
→ ernielwl: 基因的primer 去P,如果有DNA污染就會看到含intron的那
→ ernielwl: 條band,但是樓主是細菌,最好找一段確定不會表現的基因
→ ernielwl: 來check
→ huuban: Trizol應該可以提高回收量，但我抽的樣本trizol抽不動XD
→ huuban: turbo dnase好用，我們要吃兩趟的樣本用Turbo都是一趟就好
→ Ice9: 試試加 DpnI 處理。