[求救]Frustrated phagocytosis讓人好frustrated

[aloha17 (aloha17)]

大家好

請問有沒有人有用RAW 264.7 做frustrated phagocytosis的經驗？

我已經做了好幾個月了，卻一直做不出來，很沮喪。

我是pre-coating BSA and anti-BSA，再加RAW cells，

接著用lysotracker, BODIPY, DAPI 染色，

可是常常都在做click chemistry 的時候，

發現Raw cells 都被洗掉了，

最後照confocal 的時候只剩下邊緣的細胞，也看不到signal。

想說可能是我的protocol哪有出問題了。




p.s. 以下是我的protocol，這是從別的paper看到的，

如果有人知道哪裡有問題的話，拜託指點迷津了 。

嗚嗚  謝謝！


1)      RAW cells culture in serum-free DMEM
2)      Coating glass bottom dish with 3% BSA @RT 30 min
3)      Wash 3 times (1 ml PBS/ per time)
4)      Incubate 1 mg/ml anti-BSA @RT 30 min
5)      Wash 3 times
6)      Add Raw cells (150,000 in 2 ml) + 0.2 ul lysotracker @37 1hr
7)      Move to cold room for 1 hr
8)      Incubate @ 37 for 30 min
9)      Click chemistry
        - Add 2 ml DMEM + 0.2 ul Azprop (alcohol), and incubate @37 for 10 min
        -Wash 3X PBS
        -Add 100 ul buffer + 0.1 ul BODIPY @37 for 10 min
        -Wash 3X PBS
        -Add 2 ml buffer + 2 ul DAPI, and incubate @37 for 15 min
        -Wash 3X PBS
        -Add 2 ml buffer
        -Image


--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 129.49.100.74
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1539981259.A.D14.html
推 tynse71864: glass dish 有扣 Poly-L-Lysine嗎或之類的嗎?
→ aloha17: 沒有欸…開新的plate 就直接加BSA了…
推 tynse71864: 要先預摳，晾乾後再摳 BSA
→ tynse71864: PLL 目的是為了讓細胞貼附，沒扣大部分細胞都會貼的很
→ tynse71864: 差
→ aloha17: 好的 我會試試看！謝謝你的建議
推 MDCCLXXVI: 有證明過BSA  coat的上去嗎？
→ aloha17: 是從paper知道 先coat bsa