[求救] 細胞打散後放一陣子後嚴重成團無法解決

[steve42125 (Shiburin)]

大家好
不好意思又來求救了

最近在做細胞實驗時
細胞嚴重抱團的情形一直大大的困擾我
已經崩潰到欲哭無淚的地步
細胞是NSCLC的H1299

實驗步驟是這樣的
以0.5ml trypsin-EDTA消化大約3min之後以1.5ml medium中和
離心1250rpm, 5mins後去除上清以適當比例打散
打散的方法是會先用200ul pipette打大概30次
再以1ml pipette取1ml medium再打大約20次之後依pellet大小稀釋進行細胞記數
因為一次手上有3個clone會同時處理
會全部打散完之後
各取10ul進行細胞記數
所以從取完到全部數完和計算之後大概會花10分鐘

情況大概是這樣
在Counting chamber底下看沒有任何異狀，細胞顆顆分明
但是種到6cm或10cm dish之後會發現細胞嚴重抱團，幾乎是一串串葡萄裝在盤子裡的感覺
有試過拿Autopipette把盤中的液體全部吸起再pipetting幾次(但是很抖很怕噴出來)
去顯微鏡下以8字搖大約15趟左右搖勻後看有散開，
想說靜置個5~10分鐘左右再移到incubator
但大概5分鐘多之後再回去看細胞又全部抱成一坨

想問問大家有沒有什麼意見或想法
或是覺得我可以改進的地方
希望能在離心收完細胞的時候就能把細胞完全打散
然後希望盡量能不用到autopipette，因為覺得塑膠tip有點浪費.....
(雖然我開始覺得好像無可避免了.....)
畢竟種到dish才發現抱團，也不知道是不是一開始就沒打散
會讓後續的細胞記數很不準，實驗根本沒辦法進行......
希望大家救救我，被這個問題已經困擾到頭痛胃痛了QQ
先謝謝大家！


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推 tynse71864: trypsin打久一點
可是已經Trypsin到細胞都有變圓圓的，輕拍也都有一部份的細胞飄下來了
用medium沖也可以容易洗下來，這樣還要再增加時間嗎?
怕細胞會受損QQ
推 iyorain: 搖的手法改一下，米字，每個方向搖過去後要停住，不要產
→ iyorain: 生漩渦，請不會成團的人帶你搖看看吧~
因為我在顯微鏡下剛搖完的等液面靜止後看都是一顆一顆的
是靜置之後才會成團，而且團塊也是均勻分布，這樣還會跟搖的手法有關嗎?
※ 編輯: steve42125 (36.224.9.103), 11/19/2018 21:51:44
推 iyorain: 拿下來時候也注意一下漩渦 盡量穩
好 我會試試...
※ 編輯: steve42125 (36.224.9.103), 11/19/2018 23:30:06
推 tynse71864: 打散30次我覺得細胞也差不多掛了……
推 chijoan: 我都是8000rpm/3min，也不會成團捏，之前有幾次遇到，問
→ chijoan: 學姐是建議細胞不要養到非常滿，打下來後會像葡萄一樣難
→ chijoan: 打散，給你參考
謝謝你寶貴的意見！ 我會注意的!
※ 編輯: steve42125 (36.224.17.22), 11/21/2018 08:37:41
→ Ice9: 離心機條件請盡量用 rcf 表示，畢竟每家離心機大小都不一樣
→ lesswind: 8000rpm細胞不會死嗎?轉速也太高了吧