Re: [求救] 細胞打散後放一陣子後嚴重成團無法解決

[blence ( )]

※ 引述《steve42125 (Shiburin)》之銘言：

: 實驗步驟是這樣的
: 以0.5ml trypsin-EDTA消化大約3min之後以1.5ml medium中和
: 離心1250rpm, 5mins後去除上清以適當比例打散
: 打散的方法是會先用200ul pipette打大概30次
: 再以1ml pipette取1ml medium再打大約20次之後依pellet大小稀釋進行細胞記數

  細胞被打散，被離心，又被打散，應該很痛苦吧
  當你[以1.5ml medium中和時]，
  1.確認當時細胞已經一顆顆分離
  2.就可以取10ul計數，剩下的細胞有需要再去離心
  3.計數完算好用量，剛好離心完可以分盤安排實驗

  這樣就很順利了阿
  而且你的離心時間也比我的多一倍，打散的細胞也會黏得更緊密

  Counting chamber的設計應該不會一團沒打散的細胞跑進去
  用這個來判斷有沒有散開，比用dish直接看還不準確

  已經分散開的細胞，就算手勢在怎麼搖，甚至不搖
  也只會影響細胞在dish的分佈有沒有均勻
  不覺得會讓細胞5~10分鐘內團塊聚集

  另外，你每個步驟流程耗費時間跟熟悉度
  分三個clone操作是應該的


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推 steve42125: 謝謝大大額外回一篇來幫我解說！有幾個小問題想要請問
→ steve42125: 想請問你離細胞的轉速跟時間通常用多久?
→ steve42125: 想說降到1000 rpm, 3 mins 不知道夠不夠
我沒有提到降轉速阿

→ steve42125: 第二個問題是如果數完離心在打散 不會因為離心lost掉
→ steve42125: 細胞而使得細胞數不準確嗎?
如果細胞計數會明顯差異，顯然是有些細胞離心不下來
也就是不少死亡或狀況不佳的細胞，那應該去改善你的culture流程

→ steve42125: 最後是你說的分三個clone是指說一次消化一個Clone
→ steve42125: 全部消化好計算好之後再開始分盤做實驗?
→ steve42125: 還是說一次消化一盤做好一個Clone的ABC實驗分盤 再
→ steve42125: 再做下個實驗？ 不好意思問題有點多 再麻煩您的建議！
推 tynse71864: b 大應該是建議後者   三盤當三個實驗做
→ tynse71864: 目前的轉速應該沒問題
嗯，沒錯是後者
從PBS wash開始到細胞放回去養，時間越短越好
※ 編輯: blence (140.109.40.29), 11/20/2018 11:35:49
推 steve42125: 了解了！ 謝謝B大  我會試試看你的建議  謝謝你！