[求救] 濕式transfer 低分子量東西很少?

[TsushimaRiko (津島梨子 善子の小守護進)]

因為我要看的份子量從110kDa的apaf1到到17的LC3都有


所以我試著用12%SDS-PAGE去transfer:

平常會先各跑一片膠後染coomassie blue去看sample中蛋白濃度去做微調
再跑transfer
power是用bio-Rad
用的是hybond的NC膜
transfer條件老師是教300mA，90min
奇怪的是兩個月前測條件時覺得這個條件還可以

但過一陣子發現caspase3的部分(即分子量32以下)染抗體幾乎染不到 不然就是染不均
勻

想當然LC3也是染不到的

回去看一開始跑的SDS PAGE
32kDa以下的蛋白確實比上半部分少但不至於全白

有時候拍冷光 時間間隔設15秒，靈敏度調super 依舊得拍到快900秒才有東西

一直想換條件但不太敢跟老師學姐講
該怎麼換條件自己也沒有頭緒

主要想問各位想看caspase3時都習慣用什麼條件去transfer

我這樣tran有沒有什麼問題?

有需要的話我明天到實驗室會附上拍好的冷光照片 或是有缺什麼需要放上來的




*突然想到雖然固定300mA，但我還是會觀察transfer期間電壓的變化
正常情況下電壓會從160V左右慢慢降到150左右 最後穩定在145上下
這時候tran出來的actin是最漂亮的

有時候tran的期間電壓不對會染不出東西
老師推測可能是學校插座的電流電壓問題什麼的老師也沒辦法有一個合理的解釋

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.141.192.10
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1542823807.A.894.html
推 tynse71864: transfer bfr有 MeOH 嗎
tris-base 3.03g+glycine14.4g加水到800ml

+

200ml甲醇
※ 編輯: TsushimaRiko (223.141.192.10), 11/22/2018 12:21:56
推 as862437: transfer buffer 用的次數？
推 as862437: 做過10kDa的小分子(6E10)，印象是低電壓 4度on確定Trans
→ as862437: fer buffet fresh ,效果較佳
我們都是當天用早上現配的 然後冰4度c備用
那想問一下你transfer的時間是多久呢？
※ 編輯: TsushimaRiko (223.141.192.10), 11/22/2018 15:20:51
→ Ianthegood: 我的蛋白10/14kDa 用一般的protocol都轉得過去耶 有
→ Ianthegood: 用ponceau s染membrane嗎? 轉完的膠也可以染coomassie
→ Ianthegood: 看看剩多少
推 as862437: 印象中是overnight
→ xxtomnyxx: 電壓會變和插座供電沒關係，如果插座供電不穩就會讓電
→ xxtomnyxx: 壓改變，那這電源供應器可以砸掉了。V=IR 當你固定 I，
→ xxtomnyxx: V 就會隨著 R 變動，以溶液(transfer buffer)做為導體
→ xxtomnyxx: 時電阻受溫度影響會相當明顯，或是溶液不均質時也會造
→ xxtomnyxx: 成電組變動。在 transfer 時因為對溶液通電，溫度會慢
→ xxtomnyxx: 慢上升，電阻因此下降，定電流下電壓自然就會跟著下降
所以可以說 一開始電壓上不去就是transferbuffer的問題嘍?
→ xxtomnyxx: ，這其實可以做為 transfer buffer reuse 的標準，當
→ xxtomnyxx: buffer 因 reuse 次數太多而降的太低使電壓升不上去時
→ xxtomnyxx: 就是該換新的 transfer buffer 的時候了。
→ xxtomnyxx: 你的問題，我會試試看在 transfer buffer 中加 0.03~
→ xxtomnyxx: 0.1% 的 SDS。我實驗室的 transfer buffer 固定會加
加SDS會不會讓小分子太過去啊
→ xxtomnyxx: 0.0375% 的 SDS。
https://i.imgur.com/HTuJv85.jpg
transfer之後的膠
https://i.imgur.com/t5IH7jE.jpg
染caspase3後冷光 上下分別為兩個組別

https://i.imgur.com/Jxhktl8.jpg
與actin比較

→ Ianthegood: ker 不過如果你在membrane上看得到target band而weste
→ Ianthegood: rn沒有那就肯定是抗體掛了
其實我每次tran完後membrane紅染，低分子量真的比上半部少 我在想是不是sample本身就這樣?

我的sample 是hole cell去lysis
※ 編輯: TsushimaRiko (223.141.192.10), 11/22/2018 19:20:41
→ Ianthegood: 跟你的coomassie全染比較?
推 osla30: 改用PVDF膜
推 eric127: LC3就用PVDF吧～低於25kD的NC會上不去。100V, 60mins
推 joseph103331: 我們都是用NC看LC3. 用pore size決定你的時間
→ joseph103331: 0.45的話, 20kDa以下的蛋白質不要超過94V,60min
→ Ianthegood: 抗體？新的stock?
→ TsushimaRiko: 抗體已經確定是新配好的 然後coomassie blue
→ TsushimaRiko: https://i.imgur.com/sBB4v9p.jpg
→ Ianthegood: 看起來transfer沒問題啊
推 tynse71864: CMB那個是染膠吧？
推 MADAOTW: NC膜孔洞大，小分子會穿過
→ MADAOTW: 一些 youtube 的教學影片有提過
推 hank99911: 用pvdf 濕式25v 2.5 hr 轉25KDa沒問題 每次都會成功，
→ hank99911: 而且western靈敏度很高，我his純化之後的蛋白，膜上幾
→ hank99911: 乎看不到，但western訊號就很強
推 hank99911: Transfer buffer條件跟你一樣，只是我的有SDS，使用的
→ hank99911: 是invitrogen 的Xcell轉殖槽
推 danielwu0728: 膜的孔徑確定一下啊 pvdf有0.45跟0.22兩種 .45抓不
→ danielwu0728: 到30以下的
→ danielwu0728: 我不知道你那種膜會不會也有分
推 Devilxxx: 小分子的要用.22的膜而且建議縮短轉的時間至半小時一小
→ Devilxxx: 時
推 bob79620: 小分子量的蛋白要用0.22的膜,並且transfer安培數及時間
→ bob79620: 是關鍵,我之前也跑過cleaved Caspase-3 建議用 0.15 mA
→ bob79620: 12-16小時
推 skykoc: 不談你細胞本身好不好壓，或抗體買到不好的，LC3/Claved
→ skykoc: cascade-3(我習慣Pro跟cleaved都跑，但以cleaved為主）用
→ skykoc: 15%SDS-PAGE跑，transfer membrane我用過PVDF/NC，孔徑用
→ skykoc: 過.45/.2都有，沒問題的，transfer的部分100V/50min/350m
→ skykoc: A (注意V，掉到100以下時，請提高mA）尤其LC3，非常好跑
→ skykoc: 。