[求救] Matrigel seeding細胞後隔天看到網狀結構?

[steve42125 (Shiburin)]

先謝謝大家上次關於Transwell migration fix給予的建議，
終於成功了。

於是接下來用Transwell coating matrigel進行invasion實驗，
重複了兩次都以失敗告吹，
發現用棉花去除上層染色後，
整個Well竟然跟全新的一樣XD

這次在染色前先拿到顯微鏡下看看到底有沒有細胞爬過去，
不看還好，一看驚為天人，
竟然長蜘蛛網了!?
https://imgur.com/d01nT5x
(此為Seeding細胞24hr後的image)
然後稍微前後調一下焦距看起來細胞是完全沒有爬過去的，
不知道是不是因為這個蜘蛛網的關係。

因為自己是完全照著protocol在操作，
完全想不出到底哪裡發生了問題，
下面附上自己操作的詳細流程，
跪求大家幫忙隔空抓藥，感謝再感謝！

1.先將Transwell, tip, 24 well plate放進-20冰箱預冷,O/N
2.將Matrigel從-20冰箱移到冰上解凍至完全液化(大約40min)
3.將matrigel以冰的serum free medium以1:3.5的比例稀釋後，on ice 30 min
4.在chamber中加入50ul稀釋後的matrigel, 放4度冰箱15分鐘確保其完全攤平
5.移至incubator O/N使其完全固化（通常兩三個小時後和隔天都會去看一下，
都還鋪得滿平滿正常的，看起來很均質，沒有任何異狀。）
6.隔天在chamber內seeding 5*10^4 in 200ul serum free medium 的細胞液
7.下層加入800ul 10%FBS complete medium,
8.Incubate 24~26小時之後以100% methanol fix後染色。

以上為我詳細的操作流程，如果有需要我補充的地方歡迎大家告知，
也懇請大家幫忙隔空抓藥或分享自己的經驗，
看到這著蜘蛛網真是又哭又笑又不知道如何是好XDD

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※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:19:25
※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:19:43
※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 14:20:58
推 soend: 這是tube formation了？是不是matrigel coating太多了？
Tube formation是? 50ul我覺得應該還是算少的，查了不少paper好像大家都是用100ul
是怕太厚想說減半，這樣的體積厚度大概是1.5mm
※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:02:30
稍微查了一下就結果的image還真像XD，在想會不會是用的matrigel太硬了?
※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:11:01
推 soend: Tube formation是seeding HUVEC到matrigel上看angiogenesis
→ soend:  的能力，就是長得跟您的圖一樣，是網狀結構，這樣可能代
→ soend: 表您的細胞invasion 能力不強？無法穿過matrigel？
先謝謝您的補充，不過我所養的cell line是比較偏上皮型態的cancer cell(H1299)
在查paper的時候大家都是coating 100ul的體積（但是都沒寫是稀釋幾倍）
原本擔心會爬不過去所以將厚度減半，現在可能要考慮的是將稀釋倍數拉高?
※ 編輯: steve42125 (120.126.49.54), 12/22/2018 16:15:49
推 soend: 我有查到一些protocol稀釋比例可能要依細胞調整，從1/3～1/
→ soend: 8都有，所以可能要試看看才知道了
好的～謝謝您撥冗和我討論跟分享你的看法 謝謝!
※ 編輯: steve42125 (36.224.17.189), 12/22/2018 19:58:43
推 untilnow: 上皮細胞類的蠻多都會tube formation
推 Devilxxx: 哇成tube了XDDD
推 sianpa00: 想請問一下原po是如何把matrigel鋪平，我也是用50ul,但
→ sianpa00: 不管怎麼用都會有因為表面張力的凹陷，做出來細胞也聚
→ sianpa00: 集在中間，我鋪完也放4度，還試過先加100ul在吸出來QAQ
推 sianpa00: 另外想請問一下稀釋完on ice 30分 有什麼特別的用意嗎？