最近進行蛋白純化遇到一些問題
先前買機台的時候有教育訓練過，但年代久遠也不太常使用，實驗室其他人無相關使用經
驗，迫切求助版上高手～～～

機型：AKTA avant
Column : HIC

1_sample application
手動injection後會設定高鹽A相去洗loop
這時會有一些雜訊(導電度下降、高UV吸收)，原以為是solvent peak，但不含solvent的
樣品也有此現象，會是空氣跑進column嗎？還是純粹樣品沒binding上去?(但不懂導電度
為何會下降？)，而且收下來測濃度量也不多，有用鹼洗機台和column，但此情形沒改善Q
Q

2_Elution流速會影響純化效果嗎?
目前使用流速0.6mL/min實在流太久了，想問流速增加到1-1.2mL/min是否會使binding在c
olumn上的樣品，更容易被洗下來，影響純化效果？

3_回收率
使用手動針筒loading，針筒前端會殘留，injection valve也會有一段殘留
Column用低鹽B相和水洗，UV值都在baseline上，所以應該沒卡在column上
最懷疑的就是injection後A相洗loop的不明雜訊，可是收下來測UV量也沒那麼多
想問還有哪些部分會影響回收率？

4_剛才發生的新問題QQ
樣品injection後，高鹽洗loop時雜訊跑出來，結果UV降不下去還一直飆高(導電度維持正
常值)，以為樣品沒binding上收樣測濃度也很低，目前是先用高鹽把UV洗到baseline，再
繼續跑gradient做Elution，結果如何明天才知道，就是不知道為何UV會突然飆高啊啊啊(
崩潰)

麻煩大家了～～～謝謝～～QQ

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 123.195.190.114
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1548262382.A.24D.html
→ Ianthegood: 個人沒用過hic 不過經驗是流速絕對影響 前面那個peak
→ Ianthegood: 大概是pressure peak 回收量低很有可能是你sample loa
→ Ianthegood: d太少
推 july81212: 導電度應該是有殘留低鹽度的buffer在loop loop本身要2
→ july81212: -3倍體積才能完全填充 不過殘留量小不太會影響binding
→ july81212:
推 july81212: 另外調流速前要先看你要的peak分辨度如何 一般會先從g
→ july81212: radient 調完再調整流速部分
推 july81212: 雜訊我想先不管量的問題 洗出時間在injection後 有小
→ july81212: 於2CV 也有可能是unbinding protein 建議跑個膠check
→ july81212: 一下 如果沒有你的target 那就不用太擔心
→ wizchoco: 感謝大大們回答～～loop在使用前都有先用大於5CV的水和
→ wizchoco: 大於5CV的高鹽去洗了
→ wizchoco: 回收率部分，有用低鹽和水去洗，都沒洗出什麼，但用0.1N
→ wizchoco:  NaOH去洗，就有高UV吸收被洗出來
→ wizchoco: 看來是卡在column上QQ
→ Ianthegood: 只能用hic? 要不試試iex?
→ wizchoco: 目前沒辦法換IEX QQ
※ 編輯: wizchoco (123.195.190.114), 01/24/2019 23:42:03
※ 編輯: wizchoco (123.195.190.114), 01/24/2019 23:46:29
推 rasaze: 高鹽有時會造成小鹽塊析出卡在detection cell用大量水溶
→ rasaze: 解洗掉就好，之前做高鹽樣本有遇過，給您參考
推 rickson: 恩
推 windcloud27: 我這邊的業務是教說每次跑完高鹽的buffer後都要用熱
→ windcloud27: 水沖一遍機器