[求救] 關於16s rDNA的qPCR問題

[Cappello (帽子)]

目前是研究生
老闆要我做不同採樣方法得到的菌量差異
但本身對分生方面很陌生


他的意思是採樣完後抽dna跑qPCR
（我是參考paper上使用16s rRNA primer去夾）
看Ct值去比較菌量多寡
我一直覺得這方法有很多疑點
(姑且先不論dna的萃取效率)
但是老闆卻叫我照他說的做就對了
身邊也沒有專人能提點
所以想想請問板上的專家
這樣是真的可行的嗎


後來是有開始做qPCR的實驗
(使用sybr的mixer)
結果發現連作為blank的水Ct值都有30左右
因為採樣的菌量相當之少
我的樣品則在26之間浮動
使用的水有過0.22膜也滅過菌了
耗材也是用完就丟
想請問是環境污染所致嗎
也有考慮到mixer本身就有dna的殘留問題
想請問有沒有能夠改善的方法


感謝各位撥冗閱讀


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.235.45
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1552194106.A.439.html
→ blence: 好奇想知道你對於qPCR用來推測菌量的疑點是什麼？
因為之前有看到好像不同細菌他們的16s rRNA copy數目不同，這樣是不是會有誤差呢?
另外是不是使用某種菌做標準曲線求總菌數的意義也不大了這樣
還有因為是做相對定量，請教一下reference gene要如何選擇呢?謝謝
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 16:08:25
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 22:17:54
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 22:18:36
推 as862437: 水控制的那組melting curve 跟 amplify curve 先看有沒
→ as862437: 有線，可以知道是不是真的有16s片段在裡面或是雜訊
→ as862437: 同一批操作DNA萃取萃取效率應該要差不多的，除非你樣本
→ as862437: 條件差很多
推 as862437: 16s rDNA定量菌數的文章滿多的了方法應該是確立的
水的話amplify curve是有線的，melting curve比較奇怪一點，我做三重複，但每組裡面都會有一個出現兩個峰，另外三重複的CT值很不穩定，常常在35-29之間跳，我每次都有做一組E coli當作positive control，他的melting curve和Ct值都很穩定，所以現在不太清楚到底是污染還是我操作手法有問題，另外我查資料似乎都是使用16s rRNA作為control去定某個特定菌的菌量，關於這部分我可能還要再找找，謝謝A大
推 Ianthegood: 經驗中 水有訊號通常是污染
推 Ianthegood: 你的疑慮的確有重要性 但是以實用性考量現在還是以qPC
→ Ianthegood: R為主流 畢竟沒人有錢到什麼都打sequencing
後來有用分子生物等級的水做過，一樣是有訊號的QQ 所以照I大的意思是還是可以用Ct值去判斷採樣手法菌量的多寡嗎?謝謝!
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/11/2019 20:57:22
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/11/2019 20:58:34
→ fallensam: 我之前也有用這個方法測菌量sample的melting curve 通
→ fallensam: 常是同一個peak有多個表示污染了
→ fallensam: 然後純水訊號應該沒有或是微弱(Ct很大)http://i.imgur.
→ fallensam: com/0YJwnMt.jpg
回F大，所以純水會有Ct是必然的囉?我後來試了很多組primer，有些melting curve的peak就是會有很多個，如圖https://imgur.com/GzB2ziN，不知道是不是dimer的生成還是汙染之類的，謝謝你的回答!
推 Ianthegood: 回原po 對 Ct是ok的 然後樓上+1 通常水有訊號都是自己
→ Ianthegood: 手殘cross contaminate到
→ Ianthegood: 然後不只要看peak還要看強度 有時候只是noise
回I大，像這圖https://imgur.com/jjr6ePl綠色是水，藍色是E coli，其實peak差不多強，可能真的是我手法的問題吧QQ，謝謝!
→ milulittle: 是否有試過別的廠牌的mastermix? 或許可要一些試用品
→ milulittle: 看看
回m大，有喔，試了4 5 家的試劑了，P水都會有訊號
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 13:58:29
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 13:59:46
在這裡回覆一下，後來有看到幾篇paper，都有提到關於qPCR reagent污染的問題，所以用16s rRNA universal primer p水出現Ct值可能真的是無法避免的，後來我有再試了幾組primer，找到了melting curve出來peak比較乾淨的primer了，沒意外的話應該就會繼續做下去了，謝謝版上各位前輩提供的經驗!
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 14:06:50
※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 14:07:40