[求救] HEK293T IFA 問題及改善方法

[IFN113 (CY)]

(手機排版)
嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚嗚
先感謝點進來的大大們
小妹壓力爆棚快往生了

老闆一直覺得為啥核比較大顆 (??)
為什麼沒辦法染出mitochondira 均勻分佈在細胞的樣子，老闆說要看到均勻分佈的美圖呀QQ

本lab目前沒有存在做過的人，小妹我也是自己摸索試看看，無人能討論故求板上大神們解救一下嗚嗚


以下為小妹做的方式

免疫螢光染色

1.      種細胞
取2.5 ×105 cell/well  transfected 好的HEK293T cell 種於24mm圓玻片上培養16小時，去除上清液，wash PBS 2次，加入混有200nM Mitotracker的medium 培養40分鐘

2.      固定細胞
以medium 混好的3.7% Paraformaldehyde 固定細胞 15 min 後wash PBS 兩次

3.      細胞打洞
配置pernibilization buffer : 0.25% Triton X-100 加入Well內5 min

4.      Blocking
配置blocking buffer  1% BSA，以最低rpm於常溫搖晃1小時，
再用PBS buffer wash 3次

5.      加入1o Ab  (1:250) 作用O/N  隔天用PBS wash 2次
6.      加入2o Ab  Goat anti-rabbit 488  (1:250)
以最低rpm搖1小時，再用PBS wash 2次

7.      取出玻片滴上含有DAPI封片膠後蓋於載玻片上周圍塗上指甲油固定封片



然後使用Confocal (ZEISS LSM700) 拍的
我有乖乖做Z-stack QAQ...

每次做到加triton時細胞都給我飄起來說hello..
(改0.1%也是)
我已經非常非常非常小心的加任何試劑了QQ…

我要怎麼做出細胞貼的好好，然後mitochondira均勻分佈的美圖咧QAQ
大大們可以幫小妹做個檢討嗎TAT

以下圖檔:

紅色：Mitotracker
>>MitoTracker™ Red CMXRos (Thermo)
綠色：目標protein
藍色：DAPI


http://i.imgur.com/zDygmBc.jpg

謝謝!!!!!!!!




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推 tynse71864: 玻片有先摳嗎
推 tynse71864: 1. 293非常會飄，試試看玻片用 0.01%PLL摳一小時,他會
→ tynse71864: 貼的比較好，自然不易被沖下來。
→ tynse71864: 2. formaldehyde會用 PBS 之類的 bfr 稀釋吧？ 滲透壓
→ tynse71864: 過高也會影響 fixation過劇而皺縮。
推 tynse71864: 後來查了 mitotracker的建議，上述第二點就忽略吧! 可
→ tynse71864: 以從第一點改善
推 Ianthegood: 小弟跟動物細胞不熟, 2 formaldehyde的medium裡是有fb
→ Ianthegood: s的嗎?
推 Devilxxx: formaldehyde是拿來固定細胞的，有沒有fbs好像沒啥關係
→ Devilxxx: ？
推 ChloeClark: 我自己的經驗是，雖然mitotrcke「號稱」對細胞沒有毒
→ ChloeClark: 性，但事實上卻因細胞而異，我記得tracker也可以死染
→ ChloeClark: （自己查一下），可以改成固定後跟抗體一起染，或者
→ ChloeClark: 改用抗體抓粒線體，這樣圖會美一點，粒線體也較於呈現
→ ChloeClark: 它原本的形狀。另外「粒線體均勻分佈在細胞中」，欸
→ ChloeClark: 抖...有的細胞的粒線體是圍在細胞核附近的，你要不要
推 s73121: 換細胞株做，293易漂，沒漂也容易在加入試劑時變圓，當然
→ s73121: 細胞質區域就變少不容易觀察，若非得用293,那就先用poly-l
→ s73121: ysine coating試試