› 看板 Biotech 關於我們 聯絡資訊
作者forever430 (Right of Left)
看板Biotech
標題[求救] 如何提升RNA提取質量
時間Mon Apr 22 21:55:13 2019
大家好，目前提取RNA遇到一個瓶頸，想請版友指點迷津： 收集RNA的步驟是使用Trizol and Chloroform 去提取，我的樣品條件會同時重複8組，每 一組樣品下25萬顆細胞，之前都能順利收到足夠質量的RNA進行後續轉cDNA步驟，但最近 出現相同手法但是總質量都過低情況。 每次收集下來的RNA我都固定溶於10ul DEPC water，所有樣品固定使用1ml Trizol進行提 取。 第一次失敗樣品總共重複8組，我想說過程可能不小心出錯，第二次保險起見，我樣品準 備了10組（提高細胞數量），並以相同提取方法再試一次，分析濃度後如下圖： https://i.imgur.com/RGlqkx2.jpg
第三次我一樣準備10組樣品，此次改變一些手法，樣品使用冰的PBS進行清洗後（看能否 避免降解）再加入Trizol，加入Trizol後再使用刮棒進行刮除，接著把Trizol吸取到15ml 離心管，放置到冰浴上(希望能避免降解），接著再清洗第二組樣品，然後把離心管內的T rizol再抽出來加入第二組樣品，重複步驟持續下去... 分析的濃度如下圖： https://i.imgur.com/ki1w6uC.jpg
由於RNA轉成cDNA需要5ug，已連續3次出現整體RNA質量不足的情況，目前想不出哪些可能 原因造成此情況，想請版友不吝指教或者分享相關經驗。 謝謝 感激不盡 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 58.114.139.73 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1555941315.A.9F6.html
→ jjlee: 純度很高，傳統法的產率不太受降解影響。 提高細胞量增加 04/22 22:32
→ jjlee: 到10Λ6應該就ok了04/22 22:32
但是之前的組別只需要8組樣品就能收到，此次數量多2組又質量不足，實在想不透 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/22/2019 22:58:26
推 qiet: Trizol效期? 環境Rnase清潔?
04/22 23:54 謝謝Q大，效期的部分明日會確認看看，東西移出操作台後，使用的器具跟桌面都有使用7 5% E tOH/DEPC擦拭
→ jjlee: 細胞定量法是否真的準確？ 細胞類型跟之前是否一樣？ 產04/22 23:56
→ jjlee: 量降到之前的多少%？ 試劑(包含DEPC水)是否都是相同的sto04/22 23:56
→ jjlee: ck? 定量用的cuvette是否相同？ 是否能找到Nanodrop測定？04/22 23:56
謝謝J大，關於細胞數量部分，樣品處理前會使用光學顯微鏡觀察，細胞密度看起來跟以 前沒太大差異，先前8組樣品一起收下來的RNA約600-750ng/ul，總體積一樣回溶在10ul， 回溶後我都固定存放於-80冷凍2天再進行分析濃度，分析完後直接轉cDNA。 DEPC water、 Chloroform 、isopropanol都是室溫保存，但之前存放Trizol的冰箱故障 ，不知道是否有影響？ 分析濃度是以nanodrop，取出樣品1ul進行分析，分析前先以DEPC water當blank，所以之 前的濃度在分析完後剩下9ul，是足夠5ug進行後續cDNA步驟 分析的儀器如圖片，廠牌Microdigital https://i.imgur.com/FnZ9iBh.jpg
※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:11:41 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:12:32 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:20:09
→ jjlee: 之前Trizol加入後是否還需要刮？ 一般細胞Trizol加入後就04/23 00:39
→ jjlee: 溶掉了04/23 00:39
之前沒有刮耶，都是pipette沖一沖就好 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 01:07:15
推 tynse71864: 我想問一下 ，轉 cdNa 需要 5ug 是實驗要求還是按照步04/23 09:03
→ tynse71864: 驟？ 04/23 09:03
推 tynse71864: 我之前100ng 都轉完上 RT 成
功惹 04/23 09:05 T大，我是按照實驗步驟，細胞實驗是到合作實驗室進行，轉cDNA的步驟是依照對方給的 。我好像看到一線希望@@ ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 10:16:52 目前沒步驟，印象是oligo dt 1ul 、10mM dNTP 1ul、總共5ug RNA、剩下不足體積 以DEPC water補滿，總體檢13ul。 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 10:21:16
→ jjlee: 之前沒有刮耶，都是pipette沖一沖就好 →→ lysis有問題，04/23 10:42
→ jjlee: 細胞未完全溶解，RNA抽不出來04/23 10:42
J大，之前的方式是反覆吸取沖一沖，是可收到足夠量，直到出現第一次濃度過低後，我 第二次再重複一次也是如此，第三次使用刮棒重複刮個3-4次，刮棒都有去沾trizol再去 刮樣品表面 ※ 編輯: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 11:09:07
推 as862437: 轉cDNA的kit是？5ug 的總量滿高的了，目前實驗室SSIII04/23 18:17
→ as862437: 都只用 1ug 轉04/23 18:17
首先第一步是加入下列試劑 1ul Oligo dT 1ul 10mM dNTP DEPC water(最後看差多少體積補足到13ul) 5ug的RNA 總體積:13ul 最後加入的試劑如下: 5x first strand reaction buffer: 4μl 0.1M DTT: 1μl RNase out: 1μl Super Script III (SS III): 1μl 總體積為20ul 再放進機器去跑 ※ 編輯: forever430 (140.116.159.183), 04/23/2019 18:51:50
推 sarusama: 你們RNA量加太多了,RNA超過1ug會出問題,導致最後RT出來 04/23 21:25
→ sarusama: 的cDNA量參差不齊,1ug?1.5ug?2ug? sample的cDNA濃度不同 04/23 21:25
→ sarusama: cDNA是用來做其他實驗就算了,如果是用來做qPCR會有誤差04/23 21:26
推 tynse71864: 建議上網直接找 ssiii的步驟啦～ 口耳相傳的步驟很容04/23 22:07
→ tynse71864: 易出問題 XDDD04/23 22:07
忘了說明後續是做reverse PCR,感謝大家的意見 ※ 編輯: forever430 (223.138.55.87), 04/24/2019 00:50:53
推 ChloeClark: RNA dry太乾了？ 04/25 22:13
推 huuban: SSIII下5 ug不會太多啊, 而且問題根本不在這裡吧XD 04/26 00:28
→ huuban: 看起來不太像降解, 因為RNA碎片也是有濃度的喔XDD 04/26 00:29
→ huuban: 比較可能是操作上失手了, 例如C大說的dry的時候 04/26 00:29
→ huuban: 之前碰過容易殘留DNA的樣本~技術越熟練抽完濃度還越低.. 04/26 00:32
→ huuban: 發現是因為殘留的DNA越來越少的緣故 04/26 00:34
推 ChloeClark: 如果同樣的步驟跟樣本，之前做很好，現在做不休，除了 04/26 07:22
→ ChloeClark: 是否dry太乾之外（rna乾掉不溶於水），最好重新確定一 04/26 07:22
→ ChloeClark: 次自己的試劑濃度沒有問題，之前碰過有人wash rna用 04/26 07:22
→ ChloeClark: 的酒精濃度跑掉，洗之前看得到pellet，洗完pellet不 04/26 07:22
→ ChloeClark: 見，定量的濃度永遠都很低。 04/26 07:22
推 greenwind: 建議買抽RNA的kit,自此之後細胞量可不用多,quality提 04/29 00:12
→ greenwind: 高且穩定 (旭基的,記得每一sample不貴) 04/29 00:12