[求救] invasion assay

[sianpa00 (ccc)]

各位好
由於最近要做transwell invasion assay 但是不知道為什麼，細胞種在matrigel上24小
時之後都會變成白色的沉澱，各個濃度都試過了，也在96well上鋪膠試過，細胞都有貼，
但在transwell上就無法，想拜託大家幫幫忙！
以下是我的protocol,用的細胞是4T1

1.將matrigel以1:3 ,1:5, 1:7 稀釋，並coating 50ul在insert上，放37度24H

2.將細胞種在transwell上室， 5＊10^4/100ul in serum free medium

3.下室加500ul 10%FBS medium

隔天看就發現沉澱了，也沒有細胞穿過



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.54.111
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1556873340.A.381.html
→ raiyu: 實驗室之前有人作過嗎？我的方法是1：10稀釋，coating 100
→ raiyu: ul，37度放30min，用tip吸掉多的，再放細胞
沒有人做過耶，我之前試過1：10，但感覺不太成膠耶，很水漾，而且我是放24小時QQ，
另外想請問一下您用的t
ranswell是什麼牌子呢？我是corning的，不好意思麻煩您了！
※ 編輯: sianpa00 (140.112.4.206), 05/08/2019 13:54:30
※ 編輯: sianpa00 (140.112.4.206), 05/08/2019 13:55:45
→ raiyu: 是的1：10還會是很像液態的，我也是corning的
→ raiyu: google得到corning的protocol，雖然我也是看前人的
好的，感謝，那我再試試看1：10的，那可以請問一下,30分鐘後吸掉，不會幾乎沒有matr
igel嗎？
※ 編輯: sianpa00 (140.112.54.111), 05/10/2019 11:33:13
→ raiyu: 理論上孔洞有就可以了
→ raiyu: 如果是明顯的一層不就會變成在transwell上做tube formatio
→ raiyu: n了嗎？我猜你的細胞是不會行成tube的所以你才會只看到細
→ raiyu: 胞沉澱
→ raiyu: 不過建議還是找corning的protocol看一下，老闆問起來也才
→ raiyu: 有個依據
→ raiyu: 然後爬過去的細胞會是transwell的另一面，我的經驗是不太
→ raiyu: 會在下層medium中，所以你如果是看medium或下面的well是不
→ raiyu: 太會有細胞的
感謝你，我會把matrigel鋪少一點試試看，不好意思麻煩您！
※ 編輯: sianpa00 (223.136.86.184), 05/13/2019 10:08:23
不好意思再請問一下，我最近照您的步驟做，有做出來，但是吸出多的matrigel的時候，
幾乎整個吸光了，這樣是否不太正常     感覺好像根本沒有成膠，我還把時間拉長到1h
※ 編輯: sianpa00 (114.136.246.122), 05/19/2019 11:45:39
推 Devilxxx: 我之前做invasion是用80ug/mL的濃度（用medium稀釋matri
→ Devilxxx: gel）然後37C coating過夜，沒有吸除多餘的
→ Devilxxx: 查了一下當時收到的Matrigel原液濃度為9.6mg/mL 我是先
推 Devilxxx: 1:1稀釋成4.8mg/mL的stock全部分裝完，一次拿一管出來再
→ Devilxxx: 稀釋成80ug/mL的working sol做coating
→ Devilxxx: 一開始分裝就先算好每次只拿一管出來的量（稀釋後體積務
→ Devilxxx: 必超過你實際要用的總體積避免氣泡和pipetting error）
→ Devilxxx: 以稀釋倍率來看的話是120倍稀釋呢 所以原液濃度很重要
不好意思 現在才看到回覆，80ug/ml,超稀的耶，我目前是用400ug/ml左右，大概是1：20
稀釋，37度放到乾，之前看paper太擔心matrigel過稀，也許就是原液濃度不同？ 看來好
像多慮了！   謝謝你們的幫忙！
※ 編輯: sianpa00 (140.112.54.111 臺灣), 06/24/2019 15:04:36
推 Devilxxx: 濃度越高那層膠會越硬，硬的話細胞吃不掉就穿不過了不是
→ Devilxxx: 嗎？@@