[求救] Spheroid single cell離不下來

[steve42125 (Shiburin)]

各位好
最近想要將培養好的Spheroid cell打散成Single cell後
用Flow cytometry做分析

打散的部分是用Accutase常溫處理，在顯微鏡下觀察打散的效果還不錯
但是離心1250rpm, 5min之後發現Pellet有明顯縮小的情形
這邊還不打緊
硬是取了需要的細胞數到Eppendorf後準備離心進行Fix
這邊原本是用300g, 5min
但發現奇怪的是有的細胞離得下來變成pellet，
有的細胞的pellet會在管壁上排列形成一條線，
有的離完甚至看不到Pellet，
事實上在打散Spheroid cell之後可以看到細胞明顯變小，
有試過把離心速度和時間都慢慢往上調
甚至調到了3500g, 10min (對你沒看錯) 還是沒辦法讓細胞在底部形成pellet

有試過將15ml離心管跟Eppendorf都先用2.5%BSA/PBS coating
但是好像沒有太好的效果......

想請問有做過這方面實驗或是對Flow的操作流程有經驗的各位
可以提出我可能需要更改的條件
不然每次養了兩三個禮拜的Spheroid都被Eppendorf吃光根本QQ

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推 tynse71864: acctuase建議是不用neutralize, 但不知中和反應能否改
→ tynse71864: 善現象? 因為聽描述，細胞感覺快掛掉了…
確實是，應該說Accutase終止反應只需要用5倍體積的PBS稀釋就可以
所以加入PBS之後還是需要離心重懸計數，
取細胞到Eppendorf後再離心才開始固定跟染色
(我是要染Intracellular所以要先固定+打洞)，就是在最後這邊離心一直離不下來....
因為之前都是染一般貼附型的細胞都可以用正常的量去染(1*10^6)就沒遇過這種問題
Spheroid single cell的細胞數很少所以最多都只能用2.5*10^5，才遇到這個情況....
※ 編輯: steve42125 (36.224.21.211), 05/18/2019 21:18:12
推 tynse71864: 之前 T cell 用10^5 離還是有 pellet，但就是一顆點XD
→ tynse71864: D  有時候也像你說的管壁一條線，記得是加 PBS 時把壁
→ tynse71864: 上的沖下來+輕輕 pipet，再重新新離心會比較容易離下
→ tynse71864: 來
推 tynse71864: 另外如果是 fix 前一步下不來，有沒有考慮直接加等體
→ tynse71864: 積2x 濃度的 PFA  fix , 結束後離心? 之前flow這樣做
→ tynse71864: 過沒問題
推 tynse71864: 雖然很像治標不治本 XDD