[求救] 小鼠腦冷凍切片

[hachu911 (*^o^*)]

嘗試幾次小鼠腦冷切都出現大量的*小洞*
不知問題到底出在哪
想請大家幫忙看看 謝謝

我不會做灌流
所以就是取腦後至於10%福馬林 24h 常溫
蔗糖15% （PBS配置）overnight 4度冰箱
蔗糖30% （PBS配置）overnight 4度冰箱
取出擦乾腦，OCT包埋，放在-20切片機裡冷凍，切片溫度設定-20，厚度10um

另外有些部份的腦組織邊緣也是很容易跟OCT分開
一切就出現一條裂縫
導致貼片偶爾也是會摺到 我包埋前都盡量擦乾了
還是有那個步驟需要更改
或是一定需要灌流呢？
破洞問題真的很慘啊 data更本無法用



--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 1.171.19.39 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1559872879.A.D13.html
→ ddlittleq: o/n不代表組織內部已經完全跟糖水是等滲透了，這樣的
→ ddlittleq: 狀況去切當然會有冰晶
我是看腦沉至離心管底才更換的 查文獻也都這樣
請問如何才能確定脫水？
→ ddlittleq: 然後你採取取出組織後固定，後固定時間需要依照你組織
→ ddlittleq: 條件去抓，10趴已經很高了還24hr，如果要做IHC，這樣
→ ddlittleq: 的antigen應該會被這樣的固定條件影響導致染不到東西吧
→ ddlittleq: 建議多找先文獻或者去抱一下current protocol吧
※ 編輯: hachu911 (1.171.19.39 臺灣), 06/07/2019 20:58:37
推 ddlittleq: 因為原文只寫o/n，如果有下沉，切片時不太會有冰晶的
→ ddlittleq: 問題，你要不要30%後再丟一次30%，我的經驗跟sucrose這
→ ddlittleq: 步驟比較有關
推 ddlittleq: oct那段，看你的敘述感覺沒有問題，我的經驗是，如果
→ ddlittleq: 有脫落情形，多半跟組織以及oct溫度不均有關
推 ddlittleq: 如果可以能附一下結果的圖嗎，或許要看一下那些小洞是
→ ddlittleq: 不是冰晶造成
推 Devilxxx: 30%泡一個O/N後換新的30%再泡一個O/N看看
→ Devilxxx: 10% formalin還是10% PFA?如果是後者的話太高 前者safe
→ Devilxxx: 因為10% NBF裡面的PFA也是4%
推 littleQwQ: 有照片看嗎？ 試試提高溫度-10～-15度？