western blot internal control

[evayoyo]

各位前輩好

近期在跑western時經常會出現壓GAPDH糊掉的情況，但一直找不到原因是什麼QQ

做膠的部分(10%)：
下膠
H2O 4ml
30% Acrylamide/Bis 3.3ml
1.5M Tris (pH 8.8) 2.5ml
10% SDS 100ul
10% ammonium persulfate 100ul
TEMED 4ul

上膠
H2O 1.68ml
30% Acrylamide/Bis 0.51ml
1.5M Tris (pH 6.8) 0.75ml
10% SDS 30ul
10% ammonium persulfate 30ul
TEMED 3ul

30% Acrylamide/Bis和TEMED
-commercial拿來直接用
1.5M Tris (pH 8.8/pH 6.8)
-commercial 10X稀釋buffer再調pH值
10% SDS和10% ammonium persulfate
-粉末稀釋自己配
能自己配的試劑都有重新配過
還是一樣糊

跑膠的條件70V 20mins 110V 70mins
transfer的條件350mA 1hr
transfer完的marker都很完整很美
抗體的部分一抗二抗也都用其他支試過了
結果都一樣
真的很困擾QQ

有去其他實驗室用他們的器材&試劑
借跑過western
跑出來的band很是漂亮
所以應該不是手殘的問題
麻煩各位高手指點了
謝謝！！！

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.204.244.30 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1562774007.A.968.html
→ Ianthegood: 有染ponceau看看嗎 marker那行轉過去了不代表整張都
→ Ianthegood: 轉得很美
目前還沒有試過耶 除了GAPDH以外我要看的protein都壓的OK就沒想到要試
如果無法解決可能會試試看 謝謝~
推 tynse71864: 圖片支援一下
推 uouim: Running buffer 稀釋後不需調pH
沒有喔調pH值的是Tris
Running buffer跟transfer buffer稀釋完直接用我上面漏打了
→ turtle24: 附個圖比較好，有時候是壓片手抖的關係
※ 編輯: evayoyo (49.216.220.198 臺灣), 07/11/2019 11:57:12
→ evayoyo: https://i.imgur.com/4KNk51W.png
→ evayoyo: https://i.imgur.com/TJQk1hb.png
→ evayoyo: 大概是這種band會往旁邊擴散的情況
※ 編輯: evayoyo (49.216.220.198 臺灣), 07/11/2019 12:02:09
→ evayoyo: https://i.imgur.com/5ZxuH7n.png
→ Ianthegood: 看起來不像糊掉 你的lane的數量是對的 看起來是往下跑
→ Ianthegood: 的時候會擴張 染ponceau大概會看到lane變成錐形 如果
→ Ianthegood: 別的實驗室完全同樣sample沒事的話可能是膠的側邊有漏
→ Ianthegood: 之類的
好的，那我用別家實驗室的做膠儀器試試看會不會一樣，謝謝~
推 huosheng: 的確可以用ps染membrane，transfer後的gel也可以用cooma
→ huosheng: ssie染，先釐清問題點在哪裡
了解，之後會再試試看，謝謝~
※ 編輯: evayoyo (101.14.245.31 臺灣), 07/11/2019 23:31:23
推 Devilxxx: 跑膠的時候有冰浴嗎？溫度升起來也有機會糊掉加上GAPDH
→ Devilxxx: 很下面