→ e104582001: 把vector 用酵素切1刀後對大小，多切幾刀也可以 10/30 13:44
→ e104582001: 感覺像是菌體遇到特定片段修飾了植體 10/30 13:45
推 leon00521: cloning基本上花時間trouble shooting不如多做幾次吧 10/30 17:30
→ xxtomnyxx: 1. 你的 Insert 多大？ 2. 空包彈是指玩全沒有PCR產 10/30 19:15
→ xxtomnyxx: 物嗎？ 10/30 19:16
→ xxtomnyxx: Cloning primer 是你用來放大 insert 的 primer 還是指 10/30 19:18
→ xxtomnyxx: pCR2.1 上面用來 screening 的 primer？ 10/30 19:19
→ Ianthegood: 我個人是colony pcr都跑24顆的倍數啦 給你參考 10/30 21:38
→ ganbaba: PCR產物可以試試clean up後直接ligate，不要跑膠純化 10/31 12:20
→ blence: PCR完不跑膠就做clean up,怎麼知道有產物？ 10/31 19:42
推 osla30: insert用什麼DNA polymerase去P的？ 10/31 19:43
→ blence: 如果跑完膠再做clean up,何不直接把那塊膠切下來純化 10/31 19:43
推 osla30: 我想樓上只是想增加產量，跑膠取個一滴滴就好，其他拿去cl 10/31 19:55
→ osla30: ean up，回收產量比切膠來的多 10/31 19:55
→ blence: clean up好一點有95%,跑膠回收量應該也有80~90%,我是不相 10/31 20:00
→ blence: 信兩種會差多少啦,何況clean up還要浪費那一滴滴 10/31 20:00
推 osla30: 或許我們用的kit不好吧，我兩種回收率差不少XD 10/31 20:09
→ osla30: 其實seamless cloning已經很成熟了，但還是看到大家普遍在 10/31 20:13
→ osla30: 用這些傳統方法，實在覺得有點沒效率 10/31 20:13
→ xxtomnyxx: 因為$$$啊..... 10/31 23:23
→ xxtomnyxx: 我實驗室用的 PCR clean up/Gel extraction Kit 會有差 10/31 23:24
→ xxtomnyxx: ，但是可以差很多也可以差很少，然後我覺得 column 放 10/31 23:24
→ xxtomnyxx: 久了回收率都會變差，可能有氧化變質的問題吧... 10/31 23:25
→ osla30: $其實不是啥問題，反而比傳統法省時省錢，以Gibson overla 10/31 23:55
→ osla30: p方式設計primer去p insert，cotransform insert & vector 10/31 23:55
→ osla30: ，剩下的事，E.coli都會幫你完成 10/31 23:55
→ blence: 序列拿出來要仰賴PCR,每次都要送定序檢查,不愛用 11/01 00:13
推 rsggsr: gel extraction通常不會到八九成吧 大多三四成 11/01 00:21
→ blence: 那是因為許多人為了用濃的insert做ligation,elute體積少到 11/01 00:39
→ blence: 誇張,Qiagen Gel Extraction manual就有這樣的data 11/01 00:39
→ blence: 就連台廠genemark,geneaid這些也都有80%的水準了 11/01 00:43
→ osla30: overlap放進MCS後，定序一次確認ok後，未來愛怎麼搬就怎 11/01 00:51
→ osla30: 麼搬，不用再定序呀，且一般發問都是接不進去的，放不進去 11/01 00:51
→ osla30: 後面也不用談定序了 11/01 00:51
→ osla30: 自己是蠻愛用的啦XDD 11/01 00:52
→ ganbaba: 其實也不全是產量多的關係，有時候就是跑膠純化接不起來 11/01 08:48
→ ganbaba: ，pcr clean up就可以，推測是跑膠後a tail不見了@@ 11/01 08:48
→ ganbaba: 而且TA說真的不需要跑膠純化，多浪費時間而已 11/01 08:50
推 hitmd: 有很多好用的 kit ，如果$$不是問題的話 11/01 21:05
推 Ice9: 除非很確定 PCR產物很純，不然直接 clean up拿去接會很慘。 11/02 10:58
→ Ice9: 建議還是要切膠。 11/02 10:58
推 misssquid: 這個我做過，切膠回收會比較好，但還是有小片段(跑PCR 01/16 21:22
→ misssquid: 是看不到的)；ligation的時候小片段就是比較容易接上， 01/16 21:22
→ misssquid: 用力用colony pcr挑吧 01/16 21:22