[求救] EMSA 跑完只看到很淡的free probe

[belle0625070 (貝拉)]

大家好，以下是我的實驗設置：

Probe 是從一般PCR primer 開始，分別forward和reverse (36bp)，使用3’end DNA labeling kit，最後等量混合兩者，用PCR儀從90度等梯度降溫30分鐘，室溫靜置一小時後分裝，-20度保存。

核蛋白是從90%細胞匯集度100mm dish上用nuclear extract kit收集的，按說明書操作最後分裝-80度保存。

以下是我每一孔的配置，最後三孔是按照廠商給的說明書配的。

https://i.imgur.com/il7bnSR.jpg
(WT: wild type/ MT: mutant)


我的實驗結果如下：

https://i.imgur.com/RQNQLI0.jpg
（曝光時間30sec vs 3sec)

最右邊三孔是照廠商給的說明書按表操課完全沒問題，但是左邊我自己做到的部分我不知道那邊可能弄錯了，只看到很淡的free probe。

探針濃度應該已經超級高了，probe final con. 5nM，廠商給的建議終濃度只需要20fM。
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→ blence: anneal從90度??
→ belle0625070: 按照說明書從90度1分鐘後等梯度降溫到Primer art 對
→ belle0625070: 應的annealing temperature （我的是61度）剛好約30
→ belle0625070: 分鐘
→ belle0625070: *primer set
→ blence: 想知道哪一家的kit,因為thermo的EMSA kit跟RNAi core的都
→ blence: 不是從90度做起,incubate時間也不對
→ blence: 另方面如果是biotin,你也可以直接合label好的,不用自己接
→ belle0625070: 是Thermo的Kit，＃89818
→ belle0625070: https://i.imgur.com/ohZPhO3.jpg
→ Ianthegood: 照片解析度很糟耶 根本看不到你的treatment
→ skyken10: 有先把probe進行clean，測試label 的效率嗎？
推 skyken10: 你的確有加這麼多DNA，只是沒有這麼多被label的DNA被你
→ skyken10: 看見唷
推 skyken10: 在後續EMSA的實驗，沒被label到的probe也會去競爭你的蛋
→ skyken10: 白質，造成你要使用更多的蛋白質，所以希望label效率越
→ skyken10: 高越好，才能真正反應出目標蛋白對於此序列的親和力
推 Ianthegood: nuclear protein拿麼多 確定不是3’被吃掉了?