[求救] ChIP 轉錄因子negative和positive primer

[hachibuya (黃金騎士 牙狼)]

我現在要做ChIP-qPCR確認治療前後轉錄因子bind的目標promoter是否有增加

抗體(SP1和STAT3)都準備好了是CST ChIP等級的抗體

陰性對照的IgG抗體和磁珠beads也準備好了

預測promoter也從目標gene的上游2000 base估了3到4組primer

書上說最好要有轉錄因子negative control locus和positive control locus的primer

查了一下可以從文獻上面找(但查了半天查不到 人類乳癌細胞MDA231 SP1和STAT3)

有出ChIP Kit的也會附primer 但沒有要買的打算  商品也查不到序列

另外有人是從ENCODE從別人做過的ChIP-seq 找高表現和無表現的序列當positive或negative

但是ENCODE的介面實在看不太懂 細胞種類也不完全吻合

不知道有沒有人能教我怎麼設計SP1和STAT3用的negative和positive primer

還是說已經用了ChIP等級的抗體就不需要這些primer了?

已經卡了好幾天了

希望能得到幫忙 感激不盡

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 133.87.71.225 (日本)
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※ 編輯: hachibuya (133.87.71.225 日本), 11/19/2019 11:22:58
→ blence: 你想kit附的primer會是以細胞種類吻合與否當前提嗎
→ xxtomnyxx: [s]直接做ChIP-seq吧！[/s]
→ xxtomnyxx: 不過你ENCODE介面看不懂，ChIP-seq可能也看不懂怎麼分
→ xxtomnyxx: 析？就算看得懂ENCODE並找到幾個乳癌細胞株都有SP1、
→ xxtomnyxx: STAT3 binding的位置，你還是需要設計3~5對不同peak位
→ xxtomnyxx: 置的primer做positive control，以免ChIP有成功卻因為
→ xxtomnyxx: 選定的positive位置出問題沒訊號而誤以為ChIP失敗
→ hachibuya: 感謝回覆 現在努力研究ENCODE中 謝謝
→ xxtomnyxx: 你不一定要找ENCODE上有資料的基因當positive，STAT3很
→ xxtomnyxx: 多研究已經有找出它的下游基因了，從這些下游基因裡挑
→ xxtomnyxx: 幾個設計primer，做一組ChIP w/wo STAT3 antibody，只
→ xxtomnyxx: 要設計的primer在STAT3 ChIP的樣本有訊號而NC ChIP中沒
→ xxtomnyxx: 訊號或訊號超級弱，就能拿它當 positive。SP1更是一個
→ xxtomnyxx: 到處都會binding的TF，要找到它的target gene很容易，
→ xxtomnyxx: negative的primer我就比較不清楚了，不確定是要找targe
→ xxtomnyxx: site隔個5~10 kbp的位置還是要找已知不會被這些TFs
→ xxtomnyxx: binding但是在你的細胞株中有表現的基因？
→ xxtomnyxx: https://www.activemotif.com/catalog/764
→ xxtomnyxx: 上面的連結，點Documents，裡面有一些NC primer可以設
→ xxtomnyxx: 計的參考位置，它沒有給primer sequence(畢竟要賣)，但
→ xxtomnyxx: 能從那個區域去設計你的NC primer，我找了下，其實這些
→ xxtomnyxx: 資訊很容易找，你應該是要培養找到這些資料的能力的。
→ xxtomnyxx: 順便告訴你一件事吧，TFs不一定binding的位置是在
→ xxtomnyxx: promoter，除非你本來就知道或已經有人證明過會binding
→ xxtomnyxx: 在那裡，否則直接用promoter上游幾kb當做target是有可
→ xxtomnyxx: 能做不出來的，甚至binding其實是在超級遠的enhancer上
→ xxtomnyxx: ，這種情況除非你ChIP做得非常好，不然從promoter設計
→ xxtomnyxx: primer都是有風險的，雖然有些人認為這風險可以忽略...
→ hachibuya: xxtomnyxx感謝您願意分享那麼多知識給我,後來我和老師
→ hachibuya: 討論,雖然他也沒有做過ChIP,不過他認為有用IgG做陰性
→ hachibuya: 抗體的話應該就可以當作negative control,不過從您給的
→ hachibuya: 連結,我會試著從上面寫的Gene desert上設計看看,另外
→ hachibuya: 關於binding site,我現在試著從ENCODE上別人做過的ChIP
→ hachibuya: seq上找看看,我想看的基因確實在上游附近有滿高倍的表
→ hachibuya: 我會從這些區域100bp前後設計primer,再加上電腦模擬的
→ hachibuya: 幾個binding site去設計primer,看做不做得出來 謝謝您