[求救] western blot 小分子蛋白跑不出來

[jpkiku0211 (YY)]

(手機排版亂掉抱歉QQ)
目標蛋白分子大小為17kDa, internal control 45kDa
下樣為25ug
上膠7.5% 下膠15%
Running的時候120V 20min過上下膠交界線就改100V 2hr直到marker跑開接近1/5底板時停止
使用NCm，有接受別人建議先泡methanol結果爛掉(?)於是換新
Transfer(濕轉)條件有試過200mA/45min、200mA/1hr、300mA/90min、300mA/2hr
Transfer的話除了200mA/1hr有完全的transfer過去，剩下的都會殘留在膠上，沒有染膠所
以確認方式就是看marker是否完全轉過
尤其200mA/45min的後續wash的時候連marker都會被洗掉近乎沒有
Actin都有跑出來也是對的位置
但目標蛋白的membrane，會看到一些band卡在裁切最上緣或最下緣，總之不是目標位置
想問是transfer的條件或是Running 的問題嗎？
或是要改成PVDF嗎？
謝謝大家！

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.204.230.11 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1574759263.A.ED1.html
→ blence: 有人建議你把NC跑methanol？
→ a90648: NC泡methanol就融掉了阿 他說的是PVDF吧
→ a90648: 你要確認清楚啊
我有確認過，是說NCm泡沒錯，我也是泡了就溶掉QQ後來問說沾一下，但也是沾一下就爛掉

※ 編輯: jpkiku0211 (180.204.230.11 臺灣), 11/26/2019 22:01:00
推 leptoneta: 不管別人說什麼 請從單純NC或者是PVDF泡甲醇二選一
好的謝謝QQ
推 bob79620: PVDF泡甲醇，wet transfer 180mA/3 hr
請問這樣不會有tran過頭的問題嗎？
※ 編輯: jpkiku0211 (180.204.230.11 臺灣), 11/27/2019 00:44:23
推 tynse71864: 若目標只有17/45，為何要做 step gel阿?  另，這個蛋
→ tynse71864: 白大小我大概 100V 55min 就好了
→ tynse71864: 我用 pvdf
可以請問一下什麼是為什麼要做step gel的意思嗎QQ
→ bringing: 用甲醇是要活化PVDF 使表面帶正電 可跟帶負電的protein
→ bringing:  target , NC膜大部分不用甲醇
但前輩真的寫NC泡methanol還做出來東西QQ
推 Ianthegood: actin有跑出來應該是有轉好喔 你的條件也不像是會tran
→ Ianthegood: sfer過頭加上marker還在 鐵口直斷問題不是transfer
!!!但actin跑出來的band也是挺奇怪的就是，謝謝回答！！
※ 編輯: jpkiku0211 (140.112.4.192 臺灣), 11/27/2019 20:35:02
推 tynse71864: 哦我看懂了  我以為你下膠有兩種%數…沒事沒事
好的！
推 datro: 這大小還好 不過 有0.2um PVDF可以換用 NC不能碰甲醇
→ datro: 然後 有actin的圖的話 可以放上來看 然後 電流可以開到400
→ datro: 但是 可能要看看有沒有過熱 保冰效果如何
剛剛重跑了一次，這次換成0.22的PVDF膜了！transfer的話是buffer裡有放冰寶，外面放碎
冰，剛剛看是200多的marker沒有轉完全但下面的都有轉過去的樣子(100V/60min)
推 Ianthegood: 啊你講actin有跑出來位置也對 後來又講跑得很奇怪 又
→ Ianthegood: 不放圖 是要版友讀心逆
不好意思QQ!!因為上次跑的後來才發現抗體好像有問題，所以位置對但band怪怪的，這次跑
換新買的抗體，想說看如何再放圖上來，不好意思也真的感謝大家的回答！
※ 編輯: jpkiku0211 (49.219.133.17 臺灣), 11/28/2019 04:35:19
推 MADAOTW: 一般transfer buf 裡面就含有甲醇了，化掉是別的原因吧？
→ a90648: buffer裡的甲醇濃度跟你直接碰純的甲醇不能比阿
推 Ianthegood: nc可溶於甲醇 做得出來表示你前輩筆記太唬爛
→ hitmd: 誰要給搞你，NC還泡 ...
謝謝大家的建議QQ今天看actin正確，只是深淺不一濃度可能要重測；而目標蛋白則是很一
致的落在15kDa 我可能要再去看paper想想這是怎麼回事 但至少小分子蛋白跑得出來了，
謝謝各位QQQQ
※ 編輯: jpkiku0211 (140.112.96.10 臺灣), 11/29/2019 16:39:42
推 Ianthegood: 跑個qRT確定有表現啊
有跑過ELISA確認過了～
※ 編輯: jpkiku0211 (101.12.0.18 臺灣), 11/29/2019 21:06:44
推 ai760721: 請問原po後來是改什麼條件壓出來的呢？我最近也有一個9k
→ ai760721: Da的壓不出來～_～
推 joseph103331: 17kDa,怎麼看都是Blotting的問題比較多
→ joseph103331: 0.45的PVDF或NC,17kDa跑不過去的啦
→ jaren229: 比較常出現的問題都是0.22跟0.45的membrane亂用吧