作者mark24365273 (小瑋)
看板Biotech
標題[求救] 小鼠腦切片破洞
時間Fri Dec 20 23:05:01 2019
請教各位有在做小鼠動物實驗的專家們
因為實驗室內只有我在做腦組織實驗
目前在測試不讓腦破洞方法(上一批檢體因為破洞結果都不能用..)
在試過了文獻以及詢問他人的方法測試後仍然看到片子有破洞
因此想請有經驗的各位提供是否有可以改善的建議
目前做法有試過4種 以下腦照片都是正常腦
(照片主要都是染H&E )
第一種 (看到滿多文獻都這樣做)
灌流後(先PBS再用4% PFA) 取腦
4% PFA RT O/N
15% surcose in PBS until sink
30% surcose until sink
用擦手紙把水分瀝乾
OCT包埋(底下先做一層底-20預冷)
腦放入後放-80(放至少兩天)
切之前1 h 丟切片機才切
染色前先用10%中性福馬林固定 RT 15分
https://i.imgur.com/4lCeas1.jpg
https://i.imgur.com/AOuNS3Z.jpg
第二種 (灌流後不做任何處理直接包)
灌流後(先PBS再用4% PFA) 取腦
用擦手紙把水分瀝乾
OCT包埋(底下先做一層底-20預冷)
腦放入後放-80(放至少兩天)
切之前1 h 丟切片機才切
染色前先用10%中性福馬林固定 RT 15分
https://i.imgur.com/uQuPN3P.jpg
第三種 (脫水溶液換成用水配)
灌流後(先PBS再用4% PFA)取腦
4% PFA RT O/N
10% surcose in ddH2O 1 h
30% surcose until sink
用擦手紙把水分瀝乾
OCT包埋(底下先做一層底-20預冷)
腦放入後放-80
切之前1 h 丟切片機才切
染色前先用10%中性福馬林固定 RT 15分
https://i.imgur.com/bH848r1.jpg
https://i.imgur.com/0g6sBlZ.jpg
第四種 (試著把前面fix時間拉長)
灌流後(先PBS再用4% PFA)取腦
10% 中性福馬林 RT 2 d
10% surcose in ddH2O 1 h
30% surcose until sink
用擦手紙把水分瀝乾
OCT包埋(底下先做一層底-20預冷)
腦放入後放-80
切之前1 h 丟切片機才切
染色前先用10% methanol固定 RT 10分
https://i.imgur.com/0BfglLT.jpg
目前看起來是用文獻的方法還是會遇到破洞情況,且通常破的位置主要都在腦的外圍區塊
(cortex部分,腦內也會有看到)
目前有考慮
1.用液態氮凍?(看到有些文獻說這樣不會破?)
2.加長脫水時間?(梯度脫水or30% surcose放兩次)
想請問各位是否有建議其他包埋的方法以確保不會有破洞?
非常感謝各位給的建議
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 1.160.208.226 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1576854303.A.5A3.html
推 yaes111: 外圍破洞的話應該是取的時候有劃到吧 12/22 08:47
→ mark24365273: 謝謝y大建議 重新包埋後發現應該是包的時候沒有包好 01/30 17:59
→ mark24365273: 重試後就沒有問題 01/30 17:59