[求救] 3T3-L1細胞狀態詢問

[pets910011 (Littlebo)]

各位大大好，敝人最近開始養3T3-L1細胞，但在加入分化劑後群聚的細胞有些部分會往旁邊散開變成一個洞(一加入分化劑後就去顯微鏡下觀察到的現象)，想問是否是因為細胞的數量over-confluent的原因?https://imgur.com/5sJ90o9及https://imgur.com/ycQ4tb0
培養條件：
細胞數8萬/3.5cm2的well，繼代後隔天等貼盤後加入分化劑。
分化劑IBMX_O.5mM、DEXA_1uM、INS_1ug/mL
medium：DMEM/FBS+1%NEAA+L-Glutamine+Pen-Strep。

另外有幾個問題想詢問各位前輩：
1.請問preadipocyte expansion medium中的BCS血清，可否改用馬血清?
2.加入分化劑的那天是為第0天，而在第2天的時候我發現我的細胞還是有持續分裂的狀態，這樣是否代表這盤的細胞已經老化，不會再進行分化了?(代數P+21)
3.想請問如附圖的細胞滿度(https://imgur.com/WVe1kvf)是否適合加分化劑了呢?
謝謝各位前輩跟救命恩人阿~~~~
各位前輩如果還有想提醒的小細節再麻煩您們不吝嗇地提出，謝謝!

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※ 編輯: pets910011 (123.193.176.183 臺灣), 01/05/2020 17:43:38
推 telesa: 3.細胞滿度太低，我是等細胞完全confluence才加入分化劑
推 retawh: 1. FBS就足夠了
→ retawh: 2. 要剛好全滿一層細胞，不能太稀，否則無法順利分化
→ retawh: 代數不要太老
→ grassshan: 看起來細胞不夠滿+1
推 BarChiChao: 1.我是買BCRC的3T3-L1,根據BCRC的建議是要用10%BCS，
→ BarChiChao: 但我用10%FBS還是有養起來，不要學我，最好還是使用
→ BarChiChao: 與購買來源相同的血清養，血清更換對細胞的影響很大
→ BarChiChao: 3.數量不夠，一篇2012年的分化protocol文獻是以60萬
→ BarChiChao: 顆細胞養在3.5公分dish，隔天觀察貼附後才加入分化劑
→ BarChiChao: ，我覺得8萬太少，分化時所需細胞量盡量養多一點