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各位前輩好 最近做co-ip跑銀染時band都不是很理想 想麻煩前輩們幫忙看看是不是哪裡出問題> < 感激不盡!! 簡述co-ip做法: 先用protein A的beads binding antibody 再加入protein lysate mix overnight 隔天再用sample buffer 煮100度10分鐘elution 跑膠load sample時會連磁珠一起下去跑 曾經有使用過total protein lysate去做coip並染coomassie blue(步驟與前述都相同) 有band但感覺雜band超級多 https://i.imgur.com/lRODvjd.jpg
後來改抽membrane protein去做coip 用的是Thermo的MEM-PER plus kit 下800mg的protein去做binding 第一次做沒有測elute出來的蛋白濃度 下20ul含beads去染銀染 銀染用Thermo的silver stain for mass spec kit做 band的深淺看起來超不穩定 右方兩組是IgG 其他都是實驗組 https://i.imgur.com/8WPv78E.jpg
第二次做有測濃度 最後elute出來的蛋白濃度約0.3mg/ul 下40ul含beads去染銀染 右方兩組是input 中間兩組是IgG 左方兩組是我的實驗組 https://i.imgur.com/GhR5puJ.jpg
第二次下的量明明比較多 但看到的band卻比較少 看最上方好像是都卡住沒有跑下來 ( ? 猜測可能的問題有 1.膠體配錯 2.磁珠太多 3.elution用的sample buffer elute不下來 但先前染coomassie blue步驟一樣好像也沒這個問題 麻煩各位救救我了 謝謝!!!!!!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.122.220 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1579098346.A.6DF.html ※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:27:26 ※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:28:05 ※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:29:46 ※ 編輯: evayoyo (140.112.122.220 臺灣), 01/15/2020 22:31:54
xxtomnyxx: 奇怪的結果...最後一張銀染,為什麼IgG的lane沒有HC和01/16 00:54
xxtomnyxx: LC?然後做co-IP,lysate和beads反應完後要用lysis buf01/16 00:55
xxtomnyxx: 洗個3~5次你應該有做吧?01/16 00:56
xxtomnyxx: 我不建議incubate o/n,我會做一次1h, 2h, 4h, 6h 的反01/16 00:58
xxtomnyxx: 應時間測試,看哪個時間點後IP的蛋白就飽和了。此外,01/16 00:59
xxtomnyxx: beads和antibody可以先用BSA block o/n,這樣可以讓雜01/16 01:00
xxtomnyxx: band變少,但是會多一條很強很強的BSA band這個要注意
想請教跑出來的band這麼奇怪會是因為上方卡了很多像蛋白的東西沒有完整跑下來嗎?有的 我有wash,但是是用PBS wash,當初是另一個實驗室的學姐建議的,她有這樣做過說沒有問 題。請問要怎麼確定飽和呢?抱歉我是新手問題很多QQ 我coip抓下來的東西有去壓western 也有看到我目標蛋白的band,但在銀染的圖中該位置卻沒有看到band,謝謝你的建議!但是 現在銀染都沒有band QQ ※ 編輯: evayoyo (101.15.140.197 臺灣), 01/16/2020 02:34:41
xxtomnyxx: Western的靈敏度是銀染的數百數千倍以上,但是如果你銀 01/16 18:33
xxtomnyxx: 染都看不到IP的蛋白,那表示你的IP蛋白根本就表現太少 01/16 18:34
xxtomnyxx: ,連IP抓的蛋白都染不出來,和IP蛋白interact的蛋白就 01/16 18:35
xxtomnyxx: 更不可能染到了 01/16 18:35
xxtomnyxx: IP過程中要用什麼buffer去wash其實是要試的,不同的buf 01/16 18:37
xxtomnyxx: 做出來的效果會不一樣。至於卡蛋白的問題,IgG有跑下來 01/16 18:40
xxtomnyxx: 所以我覺得不是沒有band的主因 01/16 18:41