[求救] 細胞培養狀況不太佳

[ttm850130 (ttm850130)]

目前培養的細胞是口腔癌 MTCQ1 cell line，是跟別的實驗室拿來的
第一次拿的時候培養約三個禮拜後開始出現細胞碎片的狀況
測了mycoplasma有出現很淡很淡的線所以就決定不要了，又跟別人家要了一盤
結果這次繼代完又開始出現細胞碎片，狀況一直不太穩定
完全不知道該不該繼續做實驗，又不能一直跟別人要細胞T_T
（一拿回來之後馬上就有用PCR測mycoplasma，是乾淨的）

培養用品：
liquid DMEM high glucose
10% FBS
1% antibiotics (HiMedia, Penicillin+Streptomycin+Amphotericin B)
10cm dish

步驟：
1.吸掉舊 medium
2.PBS wash 兩次
3.trypsin EDTA 1ml
4.incubate 4分鐘（有想過是不是切太久，但3分半會切不乾淨）
5.加入 3ml medium 後收集離心
6.離心 300g, 5min
7.吸掉 medium 輕輕拍散之後 1ml medium (pipette) 回沖再用 4ml medium 稀釋(pipet
te
8.數細胞
9.回種
 (之前回種80萬過三天(週五~週一)直接每盤變700多萬，再下一次回種70萬過兩天卻只有
30

以下附圖
1.從別的實驗室拿來時的樣子
https://i.imgur.com/fbwXmEm.jpg
2.長700萬那次
https://i.imgur.com/z2jgwIf.jpg
3.隔天
https://i.imgur.com/B5c7eeY.jpg
4.隔天(100x)
https://i.imgur.com/0TyTv6v.jpg
5.繼代當天(100x)
https://i.imgur.com/r32CjAy.jpg

以前也養過別的細胞，沒有遇過這種狀況
可以看到說有很多碎碎的，求解QQQQQ

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→ ttm850130: 第一次要細胞的時候做了生長曲線 doubling time約17.5
→ ttm850130: 小時
推 cjsntu: 是說貴實驗室不會凍frozen stock?
如果是問為什麼不凍庫存的話之前凍過一批了，但那批解完有一樣狀況
→ Qaaaa: 碎碎的不要太多都正常吧
照片好像不明顯，但真的蠻多的，而且拿來的時候沒有碎碎的
主要是不確定細胞在這種狀況下適不適合繼續做實驗
※ 編輯: ttm850130 (111.71.127.84 臺灣), 03/25/2020 23:51:37
推 duriamon: 太擠，種少一點，細胞長太滿基因表現會改變。
請問圖五那張算太擠嗎？ 我知道700萬是爆了orz
※ 編輯: ttm850130 (61.230.115.172 臺灣), 03/26/2020 08:21:16
推 duriamon: 重解新的看看，細胞型態改變有很高的機率基因表現已經不
→ duriamon: 同了。
03/26 08:29
好，謝謝！
推 b0109135: 700萬的照片太擠，Q1應該tyrpsin 1到2分鐘就夠了
我都放到大部分細胞會流動+輕敲
不然很常沖不乾淨，不過會試試看，謝謝！
※ 編輯: ttm850130 (120.126.49.226 臺灣), 03/26/2020 13:38:53
推 florasflanaa:  trypsin縮短1-2分鐘，然後輕拍培養皿邊緣，用物理
→ florasflanaa: 力量讓細胞脫落試試看
→ florasflanaa: trypsin後細胞不需要到會流動，只要呈圓形即可
今天放兩分鐘後長這樣，輕敲不太會流
跟原培養實驗室確認過他們也是放3-5分鐘，大概真的是之前種太多太擠囧
還是謝謝建議，會盡量減少trypsin時間
https://i.imgur.com/IG1x6SY.jpg
※ 編輯: ttm850130 (223.136.113.1 臺灣), 04/03/2020 19:22:25
推 agagy: 如果考慮是trypsin的問題的話，可以考慮gibco的trypLE
→ agagy: 放20分鐘都沒什麼問題，常溫保存，好用~
→ agagy: 話說細胞照片顏色跟鏡頭沒問題嗎? 這樣看了眼睛不痛嗎XD
→ agagy: 也有可能是FBS本身髒了
推 michaelhsien: 好眼熟的細胞     我們DMEM有加L-glutamine哦！