[求救] IHC使用三層抗體呈色

[jkq (玩具)]

各位前輩好

最近因實驗需要用三層抗體來做IHC染色

我之前只用過一抗接HRP二抗，然後DAB呈色

所以想來問一下各位前輩

假設我一抗用rabbit anti actin，二抗用goat anti rabbit(FITC)，三抗
就用 goat anti FITC (HRP)

以上這三個抗體的步驟是否就是稀釋的一抗，wash，稀釋的二抗，wash，稀釋的三抗，wash，
DAB呈色

實驗步驟這樣做可以嗎

第一次做三層抗體，有什麼會跟兩層的不一樣嗎？
會有什麼要另外加的鍵結嗎

這種三層抗體是會增加靈敏度嗎  感覺有點多此一舉


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※ 編輯: jkq (61.216.30.109 臺灣), 05/18/2020 15:08:43
推 aromaQ626: 你要先確定每一層抗體都只會接上一層東西而且都接的很
→ aromaQ626: 緊
→ aromaQ626: 如果抗體專一性不夠會造成false positive訊號跟backgro
→ aromaQ626: und數值提高 降低sensitivity
→ aromaQ626: 如果接的不夠緊容易脫落 就代表每一層接上去的比例不會
→ aromaQ626: 是100趴
→ aromaQ626: 接上去的比例越低就直接導致HRP數量變少 訊號變弱 sens
→ aromaQ626: itivity變低
→ aromaQ626: 而且FITC看起來會影響呈色的訊號
推 tynse71864: 二抗改用 anti-Rb (Biotin labeled), 三抗改用 HRP-co
→ tynse71864: njugated Strepavidin呢 ?  但同一樓，你必須做每一組
→ tynse71864: 抗體單染的背景值 (尤其 FITC 本身又會發光)
推 ayenyayaya: 染螢光用DAB幹嘛？