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代PO 一開始使用1:500濃度的的一抗,曝光時間一分鐘,出來是有東西的 https://i.imgur.com/pOJQykG.png 後來新的一批細胞收下來之後(實驗條件全部相同),曝光時間才2秒就變這樣QQ,目標蛋 白直接變成白色的,其他分子量的蛋白也是全部反白了 https://i.imgur.com/04djSL0.png 之後在想是不是抗體濃度太高,調整到1:2000,結果還是一樣全部反白 https://i.imgur.com/qdF2hv7.png 實驗條件 蛋白濃度:20mg/ml 垂直式電泳電壓70~120V跑到看到蛋白在底部 Transfer(全濕式)用400mA轉90分鐘,有確定看到prestained marker在膜上 Blocking(5%脫脂奶粉)30分鐘 一抗:用過1:500,1:1000,現在是用1:2000 冰箱搖overnight PBST wash30分鐘,每10分鐘換一次 二抗:1:1000室溫搖1hr PBST wash 30分鐘,每10分鐘換一次 用機器壓片,沾ECL,曝光時間從最短1/8秒一路增加到最多2分鐘 想請問各位大大有遇過一直反白的情形嗎,壓不出正常黑色的BAND了 請問這種情況該怎麼解決呢 ? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.251.192.113 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1589357588.A.E2A.html
turtle24: 片子外面是白色的,機器設定反白? 05/13 18:21
Sylvaine: 調一下機器設定吧,會不會剛好設定跑掉了沒注意到 05/13 20:29
qiet: 軟體設定問題, 自己反相就好了 05/13 20:34
jsi: 壓片是指底片嗎? 之前遇過二抗太強,壓底片band反白 05/13 21:52
xydream: 壓tubulin是黑的沒問題,應該不是機器設定的問題 05/16 08:42
xydream: 更正:不是壓片,是直接把membrane沾好ECL放入機器裡面 05/16 08:47
xydream: 調曝光時間然後讓他顯影 05/16 08:47
joann88431: 可以稀釋ECL試試看 有時候是band燒掉反白 05/16 12:34
bob79620: 感覺像燒掉了 05/16 18:37
xydream: 那請問會跟曝光時間有關嗎,還是單純是ECL濃度問題 05/17 00:55
xydream: 有試過減短曝光時間,但不是沒東西就是燒掉 05/17 00:55
xydream: 我會試試看減少ECL濃度的!感謝 05/17 00:55
Sylvaine: 二抗的濃度也可以再調整看看,覺得1:1000有點高 05/17 18:39
Ianthegood: 背景全黑也滿妙的 通常二抗沒濃到10倍不會這樣 05/18 16:30
xydream: 因為想確認有無東西,拉長曝光時間,然後背景就變黑,蛋 05/18 19:13
xydream: 白的位置則是反白QQ 05/18 19:13
Ianthegood: 奶粉ok嗎?其他人/抗體也壓成這樣? 05/18 20:11
xydream: https://i.imgur.com/Xh8MCJG.jpg 05/18 22:43
xydream: 同一片的tubulin是正常的,所以判斷應該不是blocking問題 05/18 22:43
antirabbit: 二抗太強了,1:10000很足夠了...... 05/19 16:53
xydream: https://i.imgur.com/a5B82iK.jpg跑了一二抗都1:10000的 05/19 18:15
xydream: 結果,一樣的問題,不過最底部(分子量最小的地方有黑黑 05/19 18:15
xydream: 的band),真的很妙.... 05/19 18:15
Ianthegood: 再稀釋 不然用bsa來block看看 05/21 07:00
zoom8080: 黑色band是反相後的影像,亮band是原始影像.. 08/28 01:43