[求救] WB 有半邊的band會消失

[derren (我想要ㄉ幸福M)]

求救版上的大大們

最近做了幾次WB都是不同sample來自動物或細胞,用濕式transfer

但都遇到同樣的問題

如圖https://imgur.com/a/w6eY5lN

有一個target右半邊大約從well 6-7地方 (10 well)開始的band都會消失

甚至有一個actin 在well 7的地方也變弱(如exp4)，

想請問大大有可能是哪裡出了問題呢?

跪求各位大大解答 感謝~~

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推 ampicillin: 沒夾緊，不然就是夾太緊
推 Ianthegood: 確定不是expression下降？actin看起來滿好的啊
推 allmighty: blocking前染個ponceau s看看transfer的效果？
推 allmighty: 還有要確認hy抗體時是否有沒泡到的地方 邊邊角角之類
→ allmighty: 的
推 lemonteas: 之前有遇過目標蛋白大於100kDa，如果一次磨很多sample
→ lemonteas: ，越後面磨的band會越淡。但是小分子的internal contro
→ lemonteas: l和ponceau s看不出差別。之後每磨好一個sample就丟到-
→ lemonteas: 20度，全部磨完再一起煮，就沒有這個問題了。
→ lemonteas: 更正，越早磨的越淡
推 Ianthegood: 樓上有放protease inhibitor?還是什麼奇妙的post-tran
→ Ianthegood: slational mod
→ lemonteas: 對~~沒有放protease inhibitor，只有加sample buffer。
→ lemonteas: 我當初猜比較早磨的蛋白會被降解，所以丟-20，但不知道
→ lemonteas: 為什麼這個現象在大分子蛋白特別明顯