→ xxtomnyxx: PCR 用 high-fidelity DNA polymerase 便宜又幾乎不出 08/21 16:11
→ xxtomnyxx: 錯，不像以前標榜 HF 還是錯一堆。 08/21 16:12
→ xxtomnyxx: 可是在傳統 RE 法長大的教授和一些學生還是會覺得 PCR 08/21 16:13
→ xxtomnyxx: 做的東西不定序不安心，而且 RE 還是比新一代的方法便 08/21 16:13
→ xxtomnyxx: 宜很多(雖然要看用什麼RE)，單純的把 insert 從A質體換 08/21 16:14
→ xxtomnyxx: 到B質體也是RE比較安定。 08/21 16:15
我本身在美國的合成生物學中心唸博班 也有去英國的實驗室交換過
基本上這些實驗室每天就是不停地做cloning
以原po的問題來說通常會用Gibson Assembly
但是只要有用到PCR的部分 不管用的酵素多好都一定還是會定序
也因為如此Gibson Assembly往往只用在小規模的cloning
日常來說最主流的就是Golden Gate cloning (Type IIs RE + DNA ligase)
還有Gloden Gate衍生出的MoClo (modular cloning)
通常把insert做成part plasmid的時候會做定序
之後的組裝過程就不用再定序了 因為沒有用到PCR
這樣對要拼大一點的質體來說比較有效率 通常20kb以內都沒甚麼問題
頂多送Addgene保存之前會定序一次
有些實驗室會用Gateway cloning 原因也差不多
另外推薦一下Addgene的Plasmids 101 (有PDF版本)
https://blog.addgene.org/plasmids-101-what-is-a-plasmid
可以對常用的cloning方法有初步的認識
通常新加入實驗室的成員我們都會請他們先瀏覽一遍
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 18.20.15.46 (美國)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1598307249.A.D0D.html
→ xxtomnyxx: MIT嗎？我在陽明幾乎沒有其他實驗室一直有需要做clonin 08/25 07:41
→ xxtomnyxx: g了。我其實沒做過gibson，倒是常用Type IIs，只是現在 08/25 07:41
→ xxtomnyxx: Type IIs可以用的酵素還太少而且都偏貴，如果需要clone 08/25 07:42
→ xxtomnyxx: 的序列是 genome 上的或是 ORF，很常遇到撞酵素而難以 08/25 07:43
→ xxtomnyxx: 下手..... 08/25 07:43
→ xxtomnyxx: 而且 Type IIs 設計成模組化之後，萬一需要在兩個設計 08/25 07:44
→ xxtomnyxx: 好的模組中間再插進一個模組會很麻煩，NEB建議Type IIs 08/25 07:44
→ xxtomnyxx: 一次連接的片段不要超過6個，雖然我最多一次接8個還很 08/25 07:45
→ xxtomnyxx: 成功，但是這樣一來能安排的模組數量就會很有限。 08/25 07:46
→ jasontang: 沒錯！所以我們insert通常都是合成的 把切位移除同時 08/25 09:49
→ jasontang: 順便做codon optimization 08/25 09:49
→ jasontang: 要在中間加新模組的確是麻煩 要額外加工 08/25 09:52
→ jasontang: 模組數量的話我們是用MoClo一層一層疊上去 理論上兩三 08/25 09:54
→ jasontang: 個酵素就夠無限疊加了 08/25 09:54