[求救] T4 DNA ligation

[janewu945 (I am who I am)]

前提
Vector : pET28b （裡面包含其他東西，總共6019bp），想切除NdeI&BamHI(30bp)，再將
insert接入
Insert : 為老鼠基因在pCMV3上（900bp)
 (restriction cut : NdeI&BamHI )

小妹我最近在做T4 ligase狀況很多

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Vector 在單切NdeI 時會多一條band
https://i.imgur.com/5quBTRl.jpg

做完ligations 時，一樣有那條band卻導致位置完全不一樣
預計切完時vector為6000bp , insert 為1000bp
卻在3000時有兩個band....= =
Insert卻只有750bp
（圖為RE CUT 做確認是否有無接上）
https://i.imgur.com/eG3BTM5.jpg

想問看看大家有沒有這樣多問題
NdeI那邊是ghost band嗎？
我已經不知道該怎麼辦了......= =
Insert有換了新的primer做還是一樣


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※ 編輯: janewu945 (49.216.167.79 臺灣), 09/10/2020 02:13:10
推 ldy: 送定序看看
→ roy047: 同意vector可能不是你的plasmid...@@ 或者挑single重抽
挑20顆菌的狀況都一模一樣，會有這種狀況嗎......囧
※ 編輯: janewu945 (49.216.167.79 臺灣), 09/10/2020 09:00:34
推 blence: pET28b裡面包含其他東西,切RE還是多檢查一下
→ blence: 前面提到insert是切下來的,後面卻說換primer做還是一樣?
→ blence: 還有這是哪一家的RE,是一般的嗎？
Vector裡面已接進去的insert沒有NdeI的切位
restriction enzyme都是跟NEB，是這一月買的。
vector實驗順序
A. re cut
1.NdeI(incubate at 37C for 1hr & heat inactive at 37C for 20min)
2.BamHI (incubate at 37C for 1 hr)

B. Gel extraction

再去測濃度完做T4 ligations




※ 編輯: janewu945 (49.216.167.79 臺灣), 09/10/2020 14:11:38
→ blence: 看樣子1.的NdeI切完沒有額外換buffer,就直接加BamHI去切?
→ xxtomnyxx: 從膠圖來看，要不是這個plasmid的純化做的非常非常差
→ xxtomnyxx: ，要不是這根本不是pET28，沒標marker大小不好判斷。
→ xxtomnyxx: 然後以我的經驗，在6000 bp的大小僅僅30 bp的差別跑膠
→ xxtomnyxx: 非常非常難分，可是你的band卻有明顯shift，我會懷疑
→ xxtomnyxx: 你的vector其實是錯的。
推 dargen78: NEB的NdeI與BamHI可以用cutsmart buffer同時切吧？應該
→ dargen78: 不需要分兩次
→ dargen78: 然後同意只切30bp下來不應該有如此大的shift