[求救]

[janewu945 (I am who I am)]

小妹上次的vector 重新跑之後就沒有雙band 的問題
但是在做ligations 卻出現跟之前一樣狀況

Ligations 完後跑NdeI&XhoI去確認insert 是否有進去

預期位置是6000bp 與1500bp
卻跑出來4000bp的位置且沒有切出東西
https://i.imgur.com/im1xZAJ.jpg

實驗順序
Vector
Re digestion(incubate 37C 1hr)>
gel extraction >
CIP(37C 10min , 80C 2min) >
T4 ligations (RT10min)

Insert
PCR >
Gel extraction >
RE Digestion(incubate 37C 1hr)>
Gel extraction >
T4 ligations

在ligations前 跑膠位置都正確
現在只有想到是問題狀況是
1.transform不完全導致後面ligations 出問題
2.ligations 時間太少（依照NEB Protocol)
3.前面NdeI的RE digestion 時間需要更長（2hr up?)

我很想送定序但老闆只要聽到定序兩個字就會炸掉QQ
想問看看大家做實驗的狀況


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.12.192.114 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1600095763.A.C6B.html
※ 編輯: janewu945 (101.12.192.114 臺灣), 09/14/2020 23:03:06
→ Ianthegood: 所以你到底是ligate完跑膠還是ligation/transformation/RE完跑膠啊
我看不懂                               09/15 00:09

實驗順序都是在ligation前，之後再做transformation 
※ 編輯: janewu945 (220.133.82.62 臺灣), 09/15/2020 00:28:28
→ Ianthegood: 所以你為什麼不transform啊
推 monkey60391: 同意樓上，不是應該ligation完直接transform，挑col
→ monkey60391: ony抽plasmid出來RE跑膠嗎
推 monkey60391: 以前做T4 ligation都是放16 ℃ o/n
推 turtle24: 挑完菌再切吧，然後建議選別的切位測試
→ turtle24: ligation的產物又切同樣酵素不就insert跟vector混合物
→ turtle24: 嗎
→ blence: T4接完如果可以讓你看到這麼多circular,那幹嘛用這麼多DNA
→ blence: 去做,只要picogram的量就夠了阿
→ xxtomnyxx: 晚點有時間的話我回一篇好了，妳的實驗設計漏了不少東
→ xxtomnyxx: 西，看這結果很難回答出什麼。
→ Ice9: Insert 在 PCR完後過column先切，不要跑膠後再切又再跑膠收
→ Ice9: 集。