Re: [求救] 質體設計是否有問題

[Ianthegood (厭惹故)]

※ 引述《nm768417 (opport)》之銘言：
: 因為構築好的質體之後要來產蛋白
: 但小弟是新手，不確定這樣設計是否會有什麼問題
: 1.會有其他雜band出現嗎？
: 2.我的那段insert前面的T7 promoter因為離insert有點距離，所以我在設計insert的時
: 候，
: 前面加了start codon，這樣會有蛋白做不出來的問題嗎？
: 3.圖中的insert大小是414bps，還有另外的是369bps，這樣在跑WB後，跑出來的結果是不
: 是會滿靠近的？
: https://i.imgur.com/Udqt0hS.jpg


   唉 還是來回一下好了

   也希望能夠幫到各位剛踏入protein expression阿鼻地獄的後進


   首先做bacterial (或是其他) expression最先要考慮的就是你最後這個蛋白要幹嘛

   這個很大一部分會限制你表現蛋白的方式跟策略

   舉例來說你需要做蛋白活性測驗 阿你又不確定蛋白能不能refold

   那可能你就得做native state purification, 意思也就是蛋白可能不能太小太soluble

   promoter可能不能太強 induction不能太熱 codon不能太optimised

   不然可能全部會被推進inclusion body

   換句話說你如果要做htrf 蛋白不需要太純 那就隨便做沒差


   然後勒 絕大多數的情況 你蛋白都要純化

   純化有兩個層面 一個是tag/chromatography 一個是competition

   首先你希望你的蛋白有很好抓的tag或是特性

   再來你希望你的蛋白很多很多 其他的雜蛋白很少很少越少越好

   所以才不會來跟你搶你的column或是純化方式嘛

   一般來講 第一道純化一定還是雜 還是要過第二道甚至第三道手續

   簡單過個gel filtration都好


   回來看原po這個例子

   第一個是你產蛋白要幹嘛

   做elisa/跑膠/跑2D/打老鼠的要求都是不一樣的

   再來為什麼要用pET32a 為什麼不用基本款的3a就好

   32a的特色是他有一個N-ter的fusion thioredoxin可以幫助protein folding

   通常你還得自己放一個切位上去 純化下來之後可以把trx切掉

   阿你現在做兩個分開 雖然前面有前輩講只要放個SD sequence上去

   細菌是polycistronic所以大概還是express得出來

   但是為什麼還要浪費資源去overexpress那個thioredoxin 大概還會比你的protein多

   到時候一定都沾在column上面 拎北鐵口直斷

   然後你這兩個蛋白mw這麼近 肯定gel filtration拉不開

   阿是不是又要再買column 唉



   最後提個小弟博班學到的 畢身絕學 跟各位分享

   做native state overexpression的話

   pET32很不錯啦 trx-His6-TEV site-protein of interest

   要自己純化TEV protease, addgene上就有 超好用 還內建histag一步純化

   但是如果還是不行 還有大絕招

   用intein system, NEB的pTXB1/pTYB1 (addgene也有, 但是可能要自己clone)

   protein of interest-GyrA

   chitin column拉下來之後用DTT可以產生auto cleavage, 完全沒有scar

   基本上超純 濃縮desalt就好了

   給各位參考

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人好   欠表

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