[求救] PBMCs上flow但抗體染不上去

[isorange (桔)]

各位大大好，我的實驗目前是從小鼠中分離出PBMCs然後染monocyte 上flow看細胞群比例
但是卡在無奈我怎麼染都染不出來！！
問過學長姊以及別家實驗室的人、抗體重買新的、步驟條件也不敢亂改
但怎麼樣就是失敗

染色抗體為：
BioLegend的PEcy7 anti-mouse CD11b 和Biotin anti-mouse Ly6c

皆在4度西反應30分鐘
Load抗體的時確認每個tip都有插入細胞液裡面

這是學姊的圖
https://i.imgur.com/7QyrY2o.jpg
這是我的圖
https://i.imgur.com/KwPEbdF.jpg

很明顯cd11b根本都沒染到！！但就是無解
請各位大大提供一些建議救救我TT

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 49.216.167.189 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1604842420.A.37C.html
推 RaventheCrow: 感覺比較像population分不開，不是完全沒染到
推 RaventheCrow: 有一部分的確有染到，所以偏右的地方APC-Cy7 hi和in
→ RaventheCrow: t的兩群有出現，但就算你整框移過去比例也不會高到
→ RaventheCrow: 像你學姐一樣，因為有一部分是沒吃到染劑/和原本pop
→ RaventheCrow: ulation沒分開，所以像被low expression的那群吃掉
→ RaventheCrow: 一部分成員
→ RaventheCrow: 應該也不是單純電壓和compensation 問題，因為分不
→ RaventheCrow: 開可以想像成是兩顆球重疊在一起，就算把外框拖移
→ RaventheCrow: 變形，重疊的部分也不會分開
→ RaventheCrow: 分不開時我成功過的方法只有重染、或改染色條件（
→ RaventheCrow: 像染色時的溫度）、換不同色的染劑（弱表現的抗原配
→ RaventheCrow: 強染劑），染色時間30分鐘應該夠長我覺的不用變（
→ RaventheCrow: 更長沒洗掉，在某些sample會high和int expression
→ RaventheCrow: 擠在一起，但Case by case)
→ RaventheCrow: 看有沒有其他更有經驗的大大願意分享(?)，因為我自
→ RaventheCrow: 己有時遇到也滿頭痛的
謝謝大大提供的方向！
推 MartianIT: 叫你學姐和你side-by-side染一次 她一個口令你一個動作
→ turtle24: 兩個人相同材料各做一次，先排除人的問題
就是學姊們已經畢業了只能隔空抓藥QQ
※ 編輯: isorange (49.216.22.31 臺灣), 11/09/2020 12:06:39
→ a90648: 避光有確實嗎？之前sorting時發生過隨著時間PE訊號越來越
→ a90648: 強，後來推斷是PE-Cy7斷了恢復成PE,不過那只發生在舊抗體
→ a90648: ，換新抗體後就沒再發生過了
→ Sylvaine: 你用接了biotin的抗體染Ly6c，有記得染二抗嗎？
→ Sylvaine: 抱歉，回太快，沒看清楚是CD11b沒染到
推 tynse71864: 有沒有可能抗體舊了染的效果不好了？
有避光且都放在冰上，已經是新買的了嗚嗚
推 tynse71864: 我蠢了沒看到....染不均勻的可能性？
謝謝大大，我下次往這個方向修正看看
→ biolegend: CD11b 跟Ly6c 是分開染還是一起染？
→ biolegend: 另外抗體clone物種來源是否都是rat ?
是一起染的喔！來源也都是一樣的
※ 編輯: isorange (101.14.194.128 臺灣), 11/10/2020 01:54:13
→ williamyang: 染個BD compBeads就可以知道抗體有沒有訊號了
→ biolegend: 請分開染  clone物種來源一樣很常會有染不到情形 除非
→ biolegend: 是不同物種 比如rat & rabbit 才可以costain 妳的學姐
→ biolegend: 當初應該是挑了不同物種的clone才costain成功
→ tynse71864: 等等樓上是 biolegend (跪
→ greenwind: 1.PECy7 channel確定可以detect到嗎? 2.換個顏色吧!
→ misssquid: 你的Buffer有加界面活性劑打洞細胞壁嗎？
→ misssquid: 細胞膜啦(蠢)