[求救] MRC-5 trypsinize後存活不佳

[steve42125 (Shiburin)]

大家好 不好意思又來打擾
最近開始養MRC-5這株Lung fibroblast
Medium的成分都是完全參照ATCC
養起來型態都挺正常的
(就是癌細胞養慣了覺得長的好慢)
只是在Trypsinized後染Trypan blue
都會有很多死細胞跟碎屑(碎屑是被切掉的fibrin?)
想請問可能的原因和改進方法
雖然種回去還是會慢慢長起來
但本來一盤能收到的細胞數就很少了
還死很多 長的又慢  好難做實驗QQ

以下附上培養跟操作的condition和protocol!

培養盤:10cm falcon dish
0.05% Trypsin-EDTA
0.08% Trypan blue in PBS
PBS

大概養到8-9成滿就會繼代
2ml PBS wash 2次後加入2ml 0.05% Trypsin-EDTA
來回Rinse約10秒後吸除Trypsin
室溫作用大約3分鐘
在顯微鏡下觀察細胞變亮，貼盤的纖維都切除為止
用Medium中和並冲下細胞後以1250rpm,5分鐘離心
去除上清液，加入1ml medium輕pipette約15次打散細胞進行計數

有試過用0.025% Trypsin以及
更溫和的Dissociation reagent(Accutase)
但都沒有好轉的現象
想請問有培養過這株細胞的前輩們分享你們培養時的條件
萬分感謝！


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.50.146 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1604930527.A.F82.html
→ xuyxup192224: 為何要先吸去Trypsin?這樣整盤幹幹的細胞本來就容
→ xuyxup192224: 易死
倒是沒有想到會乾掉的問題 謝謝提醒!
後來用Accutase的時候有把1.5ml留在dish內
→ xuyxup192224: 加trypsin反應，拍一拍細胞有浮起來加入medium/PBS
→ xuyxup192224:  pipetting將cell sol.移到離心管即可，不用先將tr
→ xuyxup192224: ypsin吸去
我會試試看 因為我看ATCC對每個細胞的Trypsin時間都說5-15分鐘...
說不定3分鐘的Trypsin都還嫌太久了!
→ xuyxup192224: 建議你再看一下ATCC的subculture的步驟https://www
→ xuyxup192224: .atcc.org/products/all/CCL-171.aspx
→ xuyxup192224: https://www.atcc.org/products/all/CCL-171.aspx
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 11/10/2020 11:00:31
※ 編輯: steve42125 (120.126.50.146 臺灣), 11/10/2020 11:02:44
推 tynse71864: trypsin應該都加下去放37度幾分鐘吧   吸掉後又放37度
→ tynse71864: 超快乾的
推 michealking: 通常都是trypsin 37度5分鐘
→ michealking: 拍一拍有下來用至少3倍medium中和
推 seanrex: 細胞來自ATCC或BCRC？我們也有遇到類似問題，但BCRC的細
→ seanrex: 胞脆弱很多，ATCC至少比較耐Trypsin，不過後來都改成Accu
→ seanrex: tase了