Western Blot有結果，SDS-page卻沒有

[nm768417 (opport)]

這是我的western
https://i.imgur.com/TVfCx4Y.jpg

這張是page
https://i.imgur.com/v6o9BWj.jpg

Western 有在目標大小上（16KDA左右），但page沒有
而且還有其他的band


樣本：0.5mM IPTG誘導純化後的elute 五管+1mM IPTG五管（結果比較明顯看到是兩個wel
l而已）

煮蛋白時間：95度 五分鐘

跑電泳時間：150V 300A 75分
轉漬：300V 400A 150分

由於實驗室的機器好像是只能拿來跑DNA的
所以電流或是電壓會有點不穩
因實驗室還未購置新機器
所以只能勉強用

Comassie blue室溫染overnight
退染在烘箱65度 overnight

以上步驟都是按照先前實驗室學長姐留下來的
且在做誘導前就有先直接煮蛋白（未破菌）

以下這張圖在跑電泳的時候有去動到或是配buffer有錯（有點忘記什麼原因）所以有點醜


WB附圖
https://i.imgur.com/xnoD002.jpg

會是什麼原因導致western blot有，但page沒結果



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.137.158.128 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1621933152.A.172.html
※ 編輯: nm768417 (114.137.158.128 臺灣), 05/25/2021 17:01:46
→ Qaaaa: 染SDSPAGE的染法可以換用銀染 也許單純濃度不夠
→ nm768417: 有去做braford assay濃度有200多ug 這樣算高嗎
→ Qaaaa: 如果蛋白質濃度爆高確染不出來 那可能先看看染劑有無配錯
→ nm768417: 了解 實驗室的染劑是從之前就一直用到現在 搞不好會有一
→ nm768417: 些問題也是有可能
推 Ianthegood: coomassie sensitivity本來就低 然後你的protocol滿奇
→ Ianthegood: 妙的
→ xxtomnyxx: 電源供應器就只是個電源供應器，不會特地去分跑DNA跑蛋
→ xxtomnyxx: 白質的，然後應該是 150V，300mA吧？而且實際上跑的時
→ xxtomnyxx: 候應該是跑不到300mA的，Transfer適用半乾嗎？300V很高
→ xxtomnyxx: 耶？
→ xxtomnyxx: 第一張圖比較有可能是PAGE的問題，因為連 Marker都跑得
→ xxtomnyxx: 很糟；第二張圖應該是染劑壞了，因為連Marker都染不太
→ xxtomnyxx: 到；第三張圖比較可能是Sample的問題，因為Marker跑得
→ xxtomnyxx: 不錯，我會覺得是overloading。然後你的marker真神奇，
→ xxtomnyxx: 竟然會在WB跟sample一起呈色？
推 tynse71864: 有些 marker真的會 XD
→ nm768417: 是300mA
→ nm768417: 第三張圖是WB 抱歉沒有說明清楚（已更新
※ 編輯: nm768417 (114.137.158.128 臺灣), 05/26/2021 12:07:38
→ nm768417: 用的是溼式
推 Ice9: 純化不好，有雜bands正常。
→ Ice9: 誘導前直接煮蛋白是什麼意思？
→ Ice9: 每個well你下多少的量？
→ nm768417: 誘導前煮蛋白意思是說，我有試過沒有破菌直接煮跟破菌
→ nm768417: 後跑純化的
→ nm768417: 每個well下20 ul
→ Ice9: 我們家普通染色會加 BSA至少一個 well當對照
→ Ice9: 所以你每個well至少 4ug，但你目標蛋白可能還不到 100ng，
→ Ice9: 所以看不出來
→ Ice9: marker的量可以當粗略的參考來比對
→ skykoc: CBB跟WB敏感度差非常多 以前純化完蛋白CBB看到一條band，
→ skykoc: 把他稀釋50倍跑WB，整個band是炸開的。